Polipéptido del factor VII comprendiendo al menos tres sustituciones en relación con la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO.

1, donde dichas sustituciones son (i) el reemplazo de F374 con cualquier otro aminoácido, (ii) reemplazo de S314 con cualquier otro aminoácido y (iii) reemplazo de L305 con cualquier otro aminoácido

Polipéptidos del factor de coagulación humano VII.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a nuevos polipéptidos del factor VIIa de coagulación humana que tienen una actividad coagulante así como a constructos polinucleótidos que codifican tales polipéptidos, vectores y células huéspedes comprendiendo y expresando el polinucleótido, composiciones farmacéuticas, usos y métodos de tratamiento.

Antecedentes de la invención

La coagulación sanguínea es un proceso que consiste en una interacción compleja de varios componentes de la sangre (o factores) que finalmente da lugar a un coágulo de fibrina. Generalmente, los componentes de sangre, que participan en lo que se ha referido como la "cascada" de coagulación, son proteínas inactivas enzimáticamente (proenzimas o zimógenos) que se convierten en enzimas proteolíticas por la acción de un activador (que en sí es un factor de coagulación activado). Factores de coagulación que han sufrido tal conversión son generalmente indicados como "factores activos", y se designan por la adición de la letra "a" al nombre del factor de coagulación (p. ej. factor VIIa).

La iniciación del proceso hemostático es mediada por la formación de un complejo entre el factor tisular, expuesto debido a una lesión de la pared de los vasos, y el factor VIIa. Este complejo entonces convierte los factores IX y X en sus formas activas. El factor Xa convierte cantidades limitadas de protrombina en trombina en la célula de soporte del factor tisular. La trombina activa las plaquetas y los factores V y VIII en factores Va y VIIIa, ambos cofactores en el proceso adicional que conduce a la explosión completa de la trombina. Este proceso incluye la generación del factor Xa por el factor IXa (en un complejo con el factor VIIIa) y ocurre en la superficie de las plaquetas activadas. La trombina finalmente convierte el fibrinógeno en fibrina resultando en la formación de un coágulo de fibrina. En los últimos años, el factor VII y el factor tisular se han revelado ser los iniciadores principales de la coagulación sanguínea.

El factor VII es una glicoproteína plasmática de traza que circula en la sangre como un zimógeno monocatenario. El zimógeno es inactivo catalíticamente. El factor VII monocatenario puede ser convertido en el factor VIIa bicatenario por el factor Xa, el factor XIIa, el factor IXa, el factor VIIa o la trombina in vitro. Se considera el factor Xa el mayor activador fisiológico del factor VII. Como otras varias proteínas plasmáticas implicadas en la hemostasis, el factor VII depende de la vitamina K para su actividad, que se requiere para la gamma-carboxilación de residuos múltiples de ácido glutámico que se agrupan cerca del amino-terminal de la proteína. Estos ácidos glutámicos gamma-carboxilados se requieren para la interacción inducida por iones metálicos del factor VII con fosfolípidos. La conversión del factor VII de zimógeno en la molécula bicatenaria activada se produce por la ruptura de un enlace peptídico interno Arg₁₅₂-Ile₁₅₃. En presencia del factor tisular, fosfolípidos y de un enlace peptídico interno Arg₁₅₂-Ile₁₅₃. En presencia del factor tisular, de fosfolípidos y de iones de calcio, el factor VIIa bicatenario activa rápidamente el factor X o el factor IX por proteolisis limitada.

Frecuentemente es deseable estimular o mejorar la cascada de coagulación en un sujeto. El factor VIIa ha sido utilizado para controlar los trastornos de sangrado que tienen varias causas tales como deficiencias de factor de coagulación (p. ej. hemofilia A y B o deficiencia de factores de coagulación XI o VII) o inhibidores de factor de coagulación. El factor VIIa ha sido usado también para controlar la hemorragia excesiva que se produce en sujetos con una cascada de coagulación de sangre que funciona normalmente (sin deficiencias de factor de coagulación o inhibidores contra cualquiera de los factores de coagulación). Este tipo de sangrado puede, por ejemplo, ser causado por una función plaquetaria defectuosa, trombocitopenia o enfermedad de von Willebrand. El sangrado también es un problema importante en relación con la cirugía y otras formas de daños a tejidos.

La patente europea nº. 200,421 (ZymoGenetics) se refiere a la secuencia de nucleótidos que codifica el factor humano VII y la expresión recombinante del factor VII en células mamíferas.

Dickinson et al. (Proc. Nati. Acad. Sci. EEUU (1996) 93, 14379-14384) se refiere a una variante del factor VII donde Leu305 ha sido reemplazado por Ala (FVII(Ala305)).

Iwanaga et al. (Tromb. Haemost. (supplement August 1999), 466, abstract 1474) se refiere a variantes de factor VIIa donde se suprimen los residuos 316-320 o se reemplazan los residuos 311-322 por residuos correspondientes de tripsina.

Las solicitudes de patente internacionales WO 01/83725 y WO 02/22776 se refieren a variantes de factor VIIa con actividad aumentada.

Existe una necesidad de variantes de factor VIIa con una actividad coagulante, variantes de actividad alta que se pueden administrar en dosis relativamente bajas, y variantes que no producen los efectos secundarios indeseables como la activación sistémica del sistema de coagulación y del sangrado, respectivamente, asociados con terapias convencionales.

Descripción de la invención

Se ha descubierto ahora que las variantes de polipéptidos del factor VIIa de coagulación humana, donde los aminoácidos Phe374 Leu305 y Ser314, de la SEC ID NO:1 se sustituyen por diferentes aminoácidos, han aumentado la actividad coagulante en comparación con el factor VIIa de coagulación humana de tipo salvaje.

Los términos "un aminoácido diferente" como se utilizan en este caso definen un aminoácido que es diferente a ese aminoácido presente naturalmente en esta posición. Esto incluye pero no se limita a éstos, aminoácidos que pueden ser codificados por un polinucleótido. En una forma de realización el término "actividad" diferente como se utiliza en este caso define la capacidad de un polipéptido del factor VII para convertir su factor X de sustrato en el factor Xa activo. La actividad de un polipéptido del factor VII puede ser medida con el "Ensayo de proteolisis in vitro" (véase el Ejemplo 4).

Los términos "actividad inherente" también incluyen la capacidad para generar trombina en la superficie de plaquetas activadas en la ausencia del factor tisular.

El residuo Phe374 se sitúa en el extremo de un a-hélix a partir del residuo 307. Este a-hélix se encuentra en forma de complejo del factor VIIa. En el factor VIIa libre (factor VIIa no ligado al factor tisular) el hélix está distorsionado y en consecuencia es posiblemente inestable. Se cree que el hélix es importante para la actividad. Las variantes según la presente invención pueden conseguir la conformación activa, la cual normalmente tiene que ser inducida por el factor tisular.

La actividad aumentada puede ser debida a una estabilización del a-hélix a partir del residuo 307, una reorientación del hélix o cualquier otro cambio en la conformación. El reemplazo del residuo Phe374 situado en el extremo del hélix, inducirá una reorientación y/o estabilización del hélix.

Debido a la actividad inherente más alta de la variante del factor VIIa descrita en comparación con el factor VIIa nativo, una dosis inferior será adecuada para obtener una concentración adecuada funcionalmente en el sitio de acción y se podrá así administrar una dosis inferior al sujeto que sufre hemorragias o que necesita una mejora del sistema hemostático normal.

El Leu305 se sitúa en el otro extremo de este a-hélix presente en forma de complejo de factor tisular del factor VIIa, que se considera importante para la actividad. La sustitución del Leu305 también puede inducir una reorientación y/o estabilización del hélix.

Los aminoácidos comprendiendo Lys157, Ser314, Lys337, Asp334, Ser336, Val158, Glu296, y Met298 se sitúan en una área prevista para incidir en la inserción del amino terminal del dominio de proteasa y de este modo en la formación de la conformación activa catalíticamente del factor VIIa que depende de un puente salino entre el grupo amino terminal de Ile153 y la cadena lateral de Asp343. Los reemplazos pueden eliminar repulsiones electroestáticas, añadir enlaces de hidrógeno o por otra parte facilitar la inserción del amino terminal.

Debido a la actividad inherente más alta de las variantes de polipéptidos del factor VIIa descritas en comparación...

1. Polipéptido del factor VII comprendiendo al menos tres sustituciones en relación con la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO.1, donde dichas sustituciones son (i) el reemplazo de F374 con cualquier otro aminoácido, (ii) reemplazo de S314 con cualquier otro aminoácido y (iii) reemplazo de L305 con cualquier otro aminoácido.

2. Polipéptido del factor VII según la reivindicación 1, donde K157 se reemplaza por cualquier otro aminoácido.

3. Polipéptido del factor VII según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, donde D334 se reemplaza por cualquier otro aminoácido.

4. Polipéptido del factor VII según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde S336 se reemplaza por cualquier otro aminoácido.

5. Polipéptido del factor VII según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde V158 se reemplaza por cualquier otro aminoácido.

6. Polipéptido del factor VII según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde E296 se reemplaza por cualquier otro aminoácido.

7. Polipéptido del factor VII según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde M298 se reemplaza por cualquier otro aminoácido.

8. Polipéptido del factor FVII según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, donde K337 se reemplaza por cualquier otro aminoácido.

9. Polipéptido del factor VII según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, donde al menos un aminoácido en las posiciones restantes en el dominio proteasa ha sido reemplazado por cualquier otro aminoácido.

10. Polipéptido del factor VII según la reivindicación 9, donde un máximo de 20 aminoácidos adicionales en las posiciones restantes en el dominio proteasa han sido reemplazados por cualesquiera otros aminoácidos.

11. Polipéptido del factor VII según cualquiera de las reivindicaciones 9-10, donde al menos un aminoácido correspondiente a un aminoácido en una posición seleccionada de 159-170 de SEC ID NO:1 ha sido reemplazado por cualquier otro aminoácido.

12. Polipéptido del factor VII según cualquiera de las reivindicaciones 9-11, donde al menos un aminoácido correspondiente a un aminoácido en una posición seleccionada de 290-304 de SEC ID NO:1 ha sido reemplazado por cualquier otro aminoácido.

13. Polipéptido del factor VII según la reivindicación 12, donde R304 ha sido reemplazado por un aminoácido seleccionado en el grupo que consiste en Tyr, Phe, Leu y Met.

14. Polipéptido del factor VII según cualquiera de las reivindicaciones 9-13, donde al menos un aminoácido correspondiente a un aminoácido en una posición seleccionada entre 306 y 312 de SEC ID NO:1 ha sido reemplazado por cualquier otro aminoácido.

15. Polipéptido del factor VII según la reivindicación 14, donde M306 ha sido reemplazado por un aminoácido seleccionado en el grupo que consiste en Asp y Asn.

16. Polipéptido del factor VII según la reivindicación 14, donde D309 ha sido reemplazado por un aminoácido seleccionado en el grupo que consiste en Ser y Thr.

17. Polipéptido del factor VII según cualquiera de las reivindicaciones 9-16, donde al menos un aminoácido correspondiente a un aminoácido en una posición seleccionada entre 330y 339 de la SEC ID NO:1 ha sido reemplazado por cualquier otro aminoácido.

18. Polipéptido del factor VII según cualquiera de las reivindicaciones 9-17, donde A274 ha sido reemplazado por cualquier otro aminoácido.

19. Polipéptido del factor VII según la reivindicación 18, donde dicho A274 ha sido reemplazado por un aminoácido seleccionado en el grupo que consiste en Met, Leu, Lys y Arg.

20. Polipéptido del factor VII según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, donde dicho K157 ha sido reemplazado por un aminoácido seleccionado en el grupo que consiste en Gly, Val, Ser, Thr, Asn, Gln, Asp, y Glu.

21. Polipéptido del factor VII según bien una u otra de las reivindicaciones 1 a 3, donde dicho D334 ha sido reemplazado por un aminoácido seleccionado en el grupo que consiste en Gly y Glu.

22. Polipéptido del factor VII según una u otra de las reivindicaciones 1 a 4, donde dicho S336 ha sido reemplazado por un aminoácido seleccionado en el grupo que consiste en Gly y Glu.

23. Polipéptido del factor VII según una u otra de las reivindicaciones 1 a 5, donde dicho V158 ha sido reemplazado por un aminoácido seleccionado en el grupo que consiste en Ser, Thr, Asn, Gin, Asp y Glu.

24. Polipéptido del factor VII según una u otra de las reivindicaciones 1 a 6, donde dicho E296 ha sido reemplazado por un aminoácido seleccionado en el grupo que consiste en Arg, Lys, Ile, Leu y Val.

25. Polipéptido del factor VII según una u otra de las reivindicaciones 1 a 7, donde dicho M298 ha sido reemplazado por un aminoácido seleccionado en el grupo que consiste en Lys, Arg, Gin y Asn.

26. Polipéptido del factor VII según la reivindicación 1, donde dicho L305 ha sido reemplazado por un aminoácido seleccionado en el grupo que consiste en Val, Tyr y Ile.

27. Polipéptido del factor VII según cualquiera de las reivindicaciones 1-26, donde dicho S314 ha sido reemplazado por un aminoácido seleccionado en el grupo que consiste en Gly, Lys, Gln y Glu.

28. Polipéptido del factor VII según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27, donde dicho F374 ha sido reemplazado por un aminoácido seleccionado en el grupo que consiste en Pro y Tyr.

29. Polipéptido del factor VII según la reivindicación 28, donde dicho F374 ha sido reemplazado por Tyr.

30. Polipéptido del factor VII según la reivindicación 8, donde dicho K337 ha sido reemplazado por un aminoácido seleccionado en el grupo que consiste en Ala, Gly, Val, Ser, Thr, Asn, Gln, Asp, y Glu.

31. Polipéptido del factor VII según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 30, donde cada aminoácido reemplazado ha sido reemplazado por cualquier otro aminoácido que puede ser codificado por constructos polinucleótidos.

32. Polipéptido del factor VII según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 31, donde dicho polipéptido del factor VII es el factor VII humano.

33. Polipéptido del factor VII según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 31, donde dicho polipéptido del factor VII es el factor humano VIIa.

34. Polipéptido del factor VII según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 33, donde la proporción entre la actividad de dicho polipéptido del factor VII y la actividad del polipéptido del factor VIIa nativo mostrada en la SEC ID NO:1 es de al menos aproximadamente 1,25.

35. Polipéptido del factor VII según la reivindicación 34, donde dicha proporción es de al menos aproximadamente 2,0, preferiblemente al menos aproximadamente 4,0.

36. Polipéptido del factor VII según la reivindicación 1, que es F374Y/L305V/S314E-FVIIa.

37. Polipéptido del factor VII según cualquiera de las reivindicaciones 1,8 o 30, que es L305V/S314E/K337A/ F374Y-FVIIa.

38. Constructo polinucleótido que codifica un polipéptido del factor VII según cualquiera de las reivindicaciones 1-37.

39. Constructo polinucleótido según la reivindicación 38, que es un vector.

40. Célula huésped comprendiendo el constructo polinucleótido según cualquiera las reivindicaciones 38 a 39.

41. Célula huésped según la reivindicación 40, que es una célula eucariótica.

42. Célula huésped según la reivindicación 41, que es de origen mamífero.

43. Célula huésped según la reivindicación 42, donde la célula se selecciona en el grupo que consiste en células CHO, células HEK y células BHK.

44. Animal transgénico no humano conteniendo y expresando el constructo polinucleótido tal como se define en la reivindicación 38.

45. Método para la producción del polipéptido del factor VII definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 37, el método comprendiendo el cultivo de una célula tal como definida en cualquiera de las reivindicaciones 40 a 43 en un medio de crecimiento apropiado en condiciones que permiten la expresión del constructo polinucleótido y la recuperación del polipéptido resultante a partir del medio de cultivo.

46. Composición farmacéutica comprendiendo un polipéptido del factor VII comprendiendo al menos dos sustituciones en relación con la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:1, donde dichas sustituciones son (i) el reemplazo de F374 por cualquier otro aminoácido, (ii) reemplazo de S314 por cualquier otro aminoácido y (iii) reemplazo de L305 por cualquier otro aminoácido; y, opcionalmente, un portador farmacéuticamente aceptable.

47. Composición farmacéutica comprendiendo un polipéptido del factor VII tal como definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 37, y, opcionalmente, un portador farmacéuticamente aceptable.

48. Uso de un polipéptido del factor VII comprendiendo al menos dos sustituciones en relación con la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:1, donde dichas sustituciones son (i) el reemplazo de F374 por cualquier otro aminoácido, (ii) reemplazo de S314 por cualquier otro aminoácido y (iii) reemplazo de L305 por cualquier otro aminoácido; para la preparación de un medicamento para el tratamiento de trastornos de sangrados o episodios de sangrados o para la mejora del sistema hemostático normal.

49. Uso de un polipéptido del factor VII tal como definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 37 para la preparación de un medicamento para el tratamiento de trastornos de sangrado o episodios de sangrado o para la mejora del sistema hemostático normal.

50. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 48 a 49 para el tratamiento de la hemofilia A o B.

51. Polipéptido del factor VII tal como definido en cualquiera de las reivindicaciones 1a 37 para un uso en forma de medicamento.