POLIPEPTIDOS CON ACTIVIDAD ENDOGLUCANASA Y POLINUCLEOTIDOS QUE CODIFICAN LOS MISMOS.
Polipéptido aislado que tiene actividad endoglucanasa, seleccionado del grupo que consiste en:
(a) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80% de identidad con el polipéptido maduro de la SEC ID n.º: 2; y (b) un polipéptido que es codificado por un polinucleótido que se híbrida bajo condiciones de astringencia al menos media-alta con (i) la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEC ID n.º: 1, (ii) la secuencia de ADN genómico que comprende la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEC ID n.º: 1, o (iii) una cadena complementaria de (i) o (ii); caracterizado por el hecho de que las condiciones de astringencia media-alta son definidas como prehibridación e hibridación a 42ºC en 5X SSPE, 0,3% de SDS, 200 µg/ml de ADN de esperma de salmón cortado y desnaturalizado y 35% de formamida, y finalmente lavando el material portador tres veces cada uno durante 15 minutos usando 2X SSC, 0,2% de SDS a una temperatura de al menos 60ºC
Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2006/016244.
Solicitante: NOVOZYMES, INC..
Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.
Dirección: 1445 DREW AVENUE,DAVIS, CA 95616.
Inventor/es: HARRIS, PAUL, LOPEZ DE LEON,ALFREDO, REY,MICHAEL, DING,HANSHU, VLASENKO,ELENA.
Fecha de Publicación: .
Fecha Concesión Europea: 28 de Octubre de 2009.
Clasificación Internacional de Patentes:
- C11D3/386E
- C12N9/42 QUIMICA; METALURGIA. › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 9/00 Enzimas, p. ej. ligasas (6.); Proenzimas; Composiciones que las contienen (preparaciones para la limpieza de los dientes que contienen enzimas A61K 8/66, A61Q 11/00; preparaciones de uso médico que contienen enzimas A61K 38/43; composiciones detergentes que contienen enzimas C11D ); Procesos para preparar, activar, inhibir, separar o purificar enzimas. › actúan sobre los enlaces beta-glucosídicos-1,4, p. ej. celulasa.
Clasificación PCT:
- C11D3/386 C […] › C11 ACEITES, GRASAS, MATERIAS GRASAS O CERAS ANIMALES O VEGETALES; SUS ACIDOS GRASOS; DETERGENTES; VELAS. › C11D COMPOSICIONES DETERGENTES; UTILIZACION DE UNA SOLA SUSTANCIA COMO DETERGENTE; JABON O SU FABRICACION; JABONES DE RESINA; RECUPERACION DE LA GLICERINA. › C11D 3/00 Otros compuestos que entran en las composiciones detergentes cubiertas por C11D 1/00. › Preparaciones que contienen enzimas.
- C12N15/00 C12N […] › Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K).
- C12N9/24 C12N 9/00 […] › actúan sobre compuestos glicosílicos (3.2).
- C12N9/42 C12N 9/00 […] › actúan sobre los enlaces beta-glucosídicos-1,4, p. ej. celulasa.
Fragmento de la descripción:
Polipéptidos con actividad endoglucanasa y polinucleótidos que codifican los mismos.
Antecedentes de la invención
La presente invención se refiere a polipéptidos aislados que tienen actividad endoglucanasa y a polinucleótidos aislados que codifican los polipéptidos. La invención también se refiere a constructos de ácido nucleico, vectores y células huéspedes que comprenden los polinucleótidos así como métodos para producir y usar los polipéptidos.
La celulosa es un polímero de la glucosa de azúcar simple unido covalentemente por enlaces beta-1,4. Muchos microorganismos producen enzimas que hidrolizan los betaglucanos. Estas enzimas incluyen endoglucanasas, celobiohidrolasas y beta-glucosidasas. Las endoglucanasas digieren el polímero de celulosa en lugares aleatorios, abriéndolo al ataque por parte de celobiohidrolasas. Las celobiohidrolasas liberan secuencialmente moléculas de celobiosa de los extremos del polímero de celulosa. La celobiohidrolasa I es una actividad 1,4-D-glucano celobiohidrolasa (E.C. 3, 2, 1, 91) que cataliza la hidrólisis de los enlaces 1,4-beta-D-glucosídicos en celulosa, celotetrosa o cualquier glucosa beta-1,4-enlazada que contenga polímero, liberando celobiosa de las extremidades reductoras de la cadena. La celobiohidrolasa II es una actividad 1,4-D-glucano celobiohidrolasa (E.C. 3,2,1,91) que cataliza la hidrólisis de los enlaces 1,4-beta-D-glucosídicos en celulosa, celotetrosa o cualquier glucosa beta 1,4-enlazada que contenga polímero, liberando celobiosa de las extremidades no reductoras de la cadena. La celobiosa es un dímero hidrosoluble beta-1,4-enlazado de glucosa. Las beta-glucosidasas hidrolizan la celobiosa a glucosa.
La conversión de materias primas celulósicas en etanol tiene las ventajas de la disponibilidad de grandes cantidades de materia prima, la conveniencia de evitar la quema o vertido de los materiales y la limpieza del combustible de etanol. La madera, los residuos agrícolas, los brotes herbáceos y los residuos sólidos municipales han sido considerados materias primas para la producción de etanol. Estos materiales consisten principalmente en celulosa, hemicelulosa y lignina. Una vez que la celulosa se convierte en glucosa, la glucosa es fácilmente fermentada por levadura en etanol.
Kvesitadaze et al., 1995, Applied Biochemistry and Biotechnology 50: 137-143, describen el aislamiento y las propiedades de una endoglucanasa termoestable de una cepa mutante termofílica de Thielavia terrestris. Gilbert et al., 1992, Bioresource Technology 39: 147-154, describen la caracterización de las enzimas presentes en el sistema de la celulosa de 255B de Thielavia terrestris. Breuil et al., 1986, Biotechnology Letters 8: 673-676, describen la producción y la localización de celulasas y beta-glucosidasas de cepas de Thielavia terrestris C464 y NRRL 8126.
Sería una ventaja en la técnica identificar las endoglucanasas nuevas que tienen propiedades mejoradas, tales como índices de hidrólisis mejorados, mejor termoestabilidad, adsorción reducida para lignina y la capacidad para hidrolizar componentes no celulósicos de biomasa, tales como hemicelulosa, además de hidrolizar celulosa. Las endoglucanasas con una amplia gama de actividades laterales en la hemicelulosa pueden ser especialmente provechosas para mejorar el rendimiento general de la hidrólisis de sustratos de biomasa ricos en hemicelulosa complejos.
Es un objeto de la presente invención proporcionar polipéptidos mejorados que tengan actividad de endoglucanasa y polinucleótidos que codifiquen los polipéptidos.
Resumen de la invención
La presente invención se refiere en un primer aspecto a polipéptidos aislados que tienen actividad de endoglucanasa seleccionada del grupo que consiste en:
La presente invención también se refiere a polinucleótidos aislados que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido del primer aspecto.
En un aspecto preferido, el polipéptido maduro son los aminoácidos 18 a 336 de la SEC ID n.º: 2. En otro aspecto preferido, la secuencia codificante del polipéptido maduro son los nucleótidos 52 a 1008 de la SEC ID n.º: 1.
La presente invención también se refiere a constructos de ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinantes y células huéspedes recombinantes que comprenden los polinucleótidos.
La presente invención también se refiere a métodos para producir tal polipéptido que tiene actividad de endoglucanasa que comprende: (a) cultivar una célula huésped recombinante que comprende un constructo de ácidos nucléicos que comprende un polinucleótido que codifica el polipéptido bajo condiciones propicias para la producción del polipéptido; y (b) recuperar el polipéptido.
La presente invención también se refiere a métodos de uso de los polipéptidos que tienen actividad de endoglucanasa en la degradación de biomasa con celulosa y hemicelulosa.
Breve descripción de las figuras
Las Figuras 1A y 1B muestran la secuencia de ADNc y la secuencia de aminoácidos deducida de una endoglucanasa (CEL7F) de Thielavia terrestris NRRL 8126 (SEC ID n.º: 1 y 2, respectivamente).
La Figura 2 muestra un mapa de restricción de pTter7F.
La Figura 3 muestra un mapa de restricción de pAILo1
La Figura 4 muestra un mapa de restricción de pBANe10.
La Figura 5 muestra un mapa de restricción de pAILo2.
La Figura 6 muestra un mapa de restricción de pAILo22.
La Figura 7 muestra la conversión relativa de betaglucano (1% p/v) después de 2 horas de hidrólisis a pH 5,5 y 60ºC.
La Figura 8 muestra la conversión relativa de betaglucano (1% p/v) después de 24 horas de hidrólisis a pH 5,5 y 60ºC.
Definiciones
Actividad endoglucanasa: El término actividad endoglucanasa
es definido en la presente como una endo-1,4-beta-D-glucano 4-glucanohidrolasa (E.C. Nº. 3,2,1,4) que cataliza la endohidrólisis de enlaces 1,4-beta-D-glicosídicos en celulosa, derivados de celulosa (tales como carboximetilcelulosa e hidroxietil celulosa), liquenina, enlaces beta-1,4 en beta-1,3 glucanos mezclados tales como beta-D-glucanos de cereales o xiloglucanos y otra materia vegetal que contiene componentes celulósicos. Para fines de la presente invención, la actividad endoglucanasa es determinada utilizando hidrólisis de carboximetilcelulosa (CMC) según el procedimiento de Ghose, 1987, Pure and Appl. Chem. 59: 257-268. Una unidad de actividad endoglucanasa es definida como 1,0 µmol de azúcares reducidos producidos por minuto a 50ºC, pH 4,8.
En un aspecto preferido, los polipéptidos de la presente invención que tienen actividad endoglucanasa además tienen actividad enzimática hacia uno o más sustratos seleccionados del grupo que consiste en xilano, xiloglucano, arabinoxilano, galactano, galactomanano, dextrano y quitina. La actividad de los polipéptidos que tienen actividad endoglucanasa en estos sustratos polisacáridos es determinada como la cantidad relativa de colorante liberado desde distintos sustratos teñidos con AZCL después de incubar los sustratos (5 g por litro) con un polipéptido que tiene actividad endoglucanasa de la presente invención (1 mg de proteína por g de sustrato) durante 1 y 92 horas sin agitar a pH 5,0 (50 mM de acetato sódico) y 50ºC. La liberación de colorante fue determinada midiendo la absorbencia...
Reivindicaciones:
1. Polipéptido aislado que tiene actividad endoglucanasa, seleccionado del grupo que consiste en:
caracterizado por el hecho de que las condiciones de astringencia media-alta son definidas como prehibridación e hibridación a 42ºC en 5X SSPE, 0,3% de SDS, 200 µg/ml de ADN de esperma de salmón cortado y desnaturalizado y 35% de formamida, y finalmente lavando el material portador tres veces cada uno durante 15 minutos usando 2X SSC, 0,2% de SDS a una temperatura de al menos 60ºC.
2. Polipéptido según la reivindicación 1, que comprende o que consiste en el polipéptido maduro de la SEC ID n.º: 2; que tiene actividad endoglucanasa.
3. Polipéptido según la reivindicación 1, que es codificado por el polinucleótido contenido en el plásmido pTter7F que está contenido en E. coli NRRL B-30837.
4. Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizado por el hecho de que el polipéptido maduro es los aminoácidos 18 a 336 de la SEC ID n.º: 2 y la secuencia que codifica el polipéptido maduro es los nucleótidos 52 a 1008 de la SEC ID n.º 1.
5. Polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1-4.
6. Constructo de ácidos nucléicos que comprende el polinucleótido según la reivindicación 5 operativamente enlazado a una o más secuencias de control que dirigen la producción del polipéptido en un huésped de expresión.
7. Célula huésped recombinante que comprende el constructo de ácidos nucléicos según la reivindicación 6.
8. Método para producir el polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que comprende: (a) cultivar una célula huésped que comprende un constructo de ácidos nucléicos que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido bajo condiciones propicias para la producción del polipéptido; y (b) recuperar el polipéptido.
9. Polinucleótido aislado obtenido (a) hibridando una población de ADN bajo condiciones de astringencia al menos media con (i) la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEC ID n.º: 1, (ii) la secuencia de ADN genómico que comprende la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEC ID n.º: 1, o (iii) una cadena complementaria de (i) o (ii); y (b) aislar el polinucleótido de hibridación, que codifica un polipéptido que tiene actividad endoglucanasa.
10. Planta transgénica, parte de planta o célula vegetal, que ha sido transformada con un polinucleótido que codifica el polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1-4.
11. Método para degradar biomasa con celulosa y hemicelulosa, que comprende tratar la biomasa con una cantidad eficaz del polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1-4 o la célula huésped según la reivindicación 7 y recuperar la biomasa degradada.
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