Oligonucleótido que contiene la estructura siguiente por lo menos una vez:

**(Ver fórmula)**5  en la que A representa el extremo 5' de un nucleótido o de una cadena de nucleótidos, B representa el extremo 3' de un nucleótido o de una cadena de nucleótidos, D es OH o CH3, y Acc es un aceptor de electrones o un aceptor de electrones sustituido con un residuo R, y R es cualquier sustituyente orgánico, y Acc se selecciona de entre un grupo que consiste de: (i) -CN, (ii) -SO2-R', en la que R' contiene por lo menos un alquilo amino-sustituido, un arilo opcionalmente sustituido o un heterociclo opcionalmente sustituido, (iii) un N+-heterociclo de seis elementos con por lo menos un átomo de N alquilado en posición orto o para, seleccionando dicho heterociclo de entre un grupo que consiste de piridinio, pirimidinio y quinolinio

La presente invención se refiere a nuevas sustancias y a procedimientos para la producción de las mismas en el campo de la química de los nucleótidos. Estas sustancias se denominan miméticos de fosfato, en los que se sustituye un grupo hidroxilo por un mimético correspondiente.

En particular, la presente invención se refiere a una nueva clase de oligonucleótidos modificados y a procedimientos para la producción de los mismos. Estado de la técnica

Ya han sido descritos anteriormente diversos procedimientos para producir nucleótidos u oligonucléotidos con un residuo fosfato modificado

Los (desoxi)oligonucleótidos sintéticos habitualmente se preparan en una fase sólida con ayuda de química de fosforamidita. Habitualmente se utilizan perlas de vidrio con poro de un tamaño definido a modo de fase sólida (abreviadas en lo sucesivo como "vidrio de poro controlado"). El primer monómero se une al soporte mediante un grupo escindible, de manera que el oligonucleótido libre pueda escindirse tras completarse la síntesis en fase sólida. Además del primer monómero contiene un grupo hidroxilo protegido, en cuyo caso habitualmente se utiliza dimetoxitritilo (DMT) como el grupo protector. El grupo protector puede eliminarse mediante tratamiento con ácido. A continuación, en el extremo 5' se acoplan sucesivamente

derivados 3' fosforamidita de (desoxi)ribonucleósidos también dotados de un grupo protector DMT, con el grupo reactivo liberado en cada caso de grupo protector DMT en un procedimiento cíclico. Alternativamente, se utilizan 5' fosforamiditas protegidas con 3'-dimetoxitritilo en la síntesis de oligonucleótidos inversos. La estrategia de Hfosfonato también se utiliza en particular para introducir modificaciones en el esqueleto de fosfatos, por ejemplo para preparar los fosforotioatos marcados radioactivamente. También ya son conocidas diversas estrategias para preparar oligonucleótidos modificados o marcados: se utilizan materiales de soporte trifuncionales según la técnica anterior para preparar oligonucleótidos marcados en el extremo 3' (patentes US nº 5.290.925 y nº 5.401.837). Las fosforamiditas marcadas en las que el grupo de marcaje se une a la fosforamidita mediante un línker C3-12 habitualmente se utilizan para preparar oligonucléotidos marcados en el extremo 5' (patentes US nº 4.997.928 y nº 5.231.191). Además, pueden introducirse modificaciones en oligonucleótidos en las bases individuales (patentes US nº 5.241.060, nº 5.260.433 y nº 5.668.266) o mediante la introducción de línkers no nucleósidos internos (patentes US nº 5.656.744 y nº 6.130.323).

Alternativamente, puede marcarse un fosfato entre nucleósidos mediante marcaje post-sintético de fosforotioatos (Hodges R.R. et al., Biochemistry 28:261-7, 1989) o mediante post-marcaje de una fosforamidita funcionalizada (Agrawal S., Methods in Mol. Biology 26,

1993, Protocols for Oligonucleotide Conjugates, Humana

Press, Totowa, NJ, capítulo 3). Sin embargo, estos métodos no han obtenido aceptación debido a la inestabilidad de las fosforamiditas y de los tioésteres de ácido fosfórico.

También ya es conocido a partir de la técnica anterior que pueden introducirse modificaciones en el residuo fosfato entre nucleósidos de los oligonucleótidos. En los casos más prominentes estos son fosfotioatos (Burgers P.M. y Eckstein F., Biochemistry 18:592-6, 1979), metilfosfonatos (Miller

P.S. et al., Biochemistry 18:5134-43, 1979) o boranofosfatos (patente WO nº 91/08213). Deben sintetizarse monómeros especiales con el fin de preparar oligonucleótidos metilfosfonato. En contraste, pueden utilizarse fosforamiditas convencionales o H-fosfonatos para sintetizar fosforotioatos y boranofosfatos, en cuyo caso la modificación borano o tio puede introducirse directamente durante o también después de la síntesis de oligonucleótidos mediante la utilización de reactivos especiales que reaccionan con el H-fosfonato trivalente o con el triéster de ácido fosfónico. Aunque todos dichos métodos conducen a oligonucleótidos modificados, los requisitos de la química de síntesis utilizada para ello no permite marcajes que puedan detectarse de esta manera o la introducción directa de grupos funcionales en el esqueleto de fosfatos de la cadena oligonucleótida durante la síntesis de oligonucleótidos.

Baschang G. y Kvita V., Angewandte Chemie 85(1):43-44, 1973, describen la reacción de un triéster de ácido fosfórico de nucleótido con azidas, tal como azida de

metilsulfonilo, para preparar tri-alquil(aril)imidofosfatos que son, sin embargo, inestables y se descomponen.

Nielsen J. y Caruthers M.H., J. Am. Chem. Soc. 110:6275-6276, 1973, describen la reacción de fosfitos de desoxinucleósidos con un grupo protector 2-ciano-1,1dimetiletilo en presencia de azida de alquilo. Además, los autores sugieren que este principio resulta adecuado para preparar nucleótidos que se modifican en el residuo fosfato sin elucidar qué tipos de modificaciones preparadas con ayuda del método dado a conocer podrían presentar ventajas particulares. En particular, los autores sugieren la introducción de residuos alquilo.

La patente WO nº 89/091221 da a conocer fosforamiditas de N-alquilo u oligonucleótidos sustituidos con N-alquilo en por lo menos un residuo fosfato que se preparan mediante oxidación de fosfitos de nucleósido (dotados de un grupo protector) con yodo en presencia de alquilaminas adecuadas.

La patente WO nº 03/02587 da a conocer la preparación de oligonucleótidos modificados en los que se convierten Hfosfatos mediante aminación en fosforamidatos.

De esta manera, todas dichas publicaciones describen la preparación de moléculas que contienen un fosforamidato en lugar de un residuo fosfato. Sin embargo, las moléculas que contienen fosforamidato son susceptibles a la hidrólisis debido a que el grupo amina se encuentra protonado en un ambiente ácido y después se sustituye con agua.

Además, la patente WO nº 01/14401 propone bloques de construcción nucleótidos u oligonucleótidos en los que se

sustituye un residuo fosfato por N-ClO3, N-NO2 o N-SO2R.

Según la enseñanza de la patente WO nº 01/14401, dichas sustancias pueden prepararse mediante reacción del grupo hidroxilo libre de un desoxinucleósido con cloruro de amidofosfonilo en presencia de piridina. Sin embargo, este tipo de preparación es complicado, laborioso e inadecuado para la síntesis rutinaria de nucleótidos o de oligonucleótidos.

El objetivo técnico que forma la base de la presente invención fue, de esta manera, preparar oligonucleótidos 10 marcados mejorados y proporcionar un procedimiento simple

para la preparación de los mismos.

Breve descripción de la invención

Por lo tanto, la presente invención se refiere a un compuesto químico, que preferentemente es un oligonucleótido 15 que contiene la estructura siguiente por lo menos una vez:

**(Ver fórmula)**

en la que A representa el extremo 5' de un nucleótido o de una cadena de nucleótidos, y B representa el extremo 3' de un nucleótido o de una

20 cadena de nucleótidos, D es OH o CH3, y Acc es un aceptor de electrones o un aceptor de

electrones sustituido con un residuo R, y R es cualquier sustituyente orgánico. 25 El aceptor de electrones Acc preferentemente se selecciona de entre un grupo que comprende:

- -CN, --SO2-R', en la que R' contiene por lo menos un alquilo amino-sustituido, un arilo opcionalmente sustituido

o un heterociclo opcionalmente sustituido,

5 -un N+-heterociclo de seis elementos en el que por lo menos un átomo de nitrógeno se encuentra alquilado y se encuentra localizado en la posición orto o para y en el que dicho heterociclo es piridinio, pirimidinio o quinolinio.

Son particularmente preferentes los oligonucleótidos en lo que R o R' solo o en combinación con el aceptor de electrones contienen una unidad detectable o un grupo funcional.

Estos oligonucleótidos se preparan según la invención mediante procedimientos que se caracterizan porque un 15 derivado de fósforo trivalente de la estructura química

siguiente:

**(Ver fórmula)**

en la que E representa un grupo metilo o un grupo hidroxilo protegido, 20 en la que A representa el extremo 5' de un nucleótido o de una fase nucleótida, y en la que B representa...

1. Oligonucleótido que contiene la estructura siguiente por lo menos una vez:

**(Ver fórmula)**

5  en la que A representa el extremo 5' de un nucleótido o de una cadena de nucleótidos, B representa el extremo 3' de un nucleótido o de una cadena de nucleótidos, D es OH o CH3, y Acc es un aceptor de electrones o un aceptor de electrones sustituido con un residuo R, y R es cualquier sustituyente orgánico, y Acc se selecciona de entre un grupo que consiste de:

(i) -CN, (ii) -SO2-R', en la que R' contiene por lo menos un alquilo amino-sustituido, un arilo opcionalmente sustituido o un heterociclo opcionalmente sustituido,

(iii) un N+-heterociclo de seis elementos con por lo menos un átomo de N alquilado en posición orto o para, seleccionando dicho heterociclo de entre un grupo que consiste de piridinio, pirimidinio y quinolinio.

2. Oligonucleótido según la reivindicación 1, caracterizado porque A y B conjuntamente comprenden por lo menos dos residuos nucleótidos.

3. Procedimiento para producir un oligonucleótido modificado según la reivindicación 1, caracterizado porque un derivado de fósforo trivalente que presenta la estructura química siguiente:

**(Ver fórmula)**

5 

en la que E representa un grupo metilo o un grupo hidroxilo protegido, en la que A representa el extremo 5' de un nucleótido o de una cadena de nucleótidos, y en la que B representa el extremo 3' de un nucleótido o de una cadena de nucleótidos, se hace reaccionar con una azida de la estructura siguiente:

N = N = N - Acc en la que Acc es un aceptor de electrones o un aceptor de electrones sustituido con un residuo R, y R es cualquier sustituyente orgánico, y Acc se selecciona de entre un grupo que consiste de:

(i) -CN, (ii) -SO2-R', en la que R' contiene por lo menos un alquilo amino-sustituido, un arilo opcionalmente sustituido o un heterociclo opcionalmente sustituido,

(iii) un N+-heterociclo de seis elementos con por lo menos un átomo de N alquilado en posición orto o para, seleccionando dicho

heterociclo de entre un grupo que consiste de

piridinio, pirimidinio y quinolinio.

4. Procedimiento según la reivindicación 3, que comprende

las etapas siguientes: a) hacer reaccionar una 3' fosforamidita con el extremo 5' OH de una cadena naciente de oligonucleótidos, b) reacción con una azida de la estructura siguiente:

N = N = N - Acc en la que Acc es un aceptor de electrones o un aceptor de electrones sustituido con un residuo R y R es cualquier sustituyente orgánico, y Acc se selecciona de entre un grupo que consiste de:

(i) -CN,

(ii) -SO2-R', en la que R' contiene por lo menos un alquilo amino-sustituido, un arilo opcionalmente sustituido o un heterociclo opcionalmente sustituido,

(iii) un N+-heterociclo de seis elementos con por lo menos un átomo de N alquilado en posición orto o para, seleccionando dicho heterociclo de entre un grupo que consiste de piridinio, pirimidinio y quinolinio.

5. Utilización de un oligonucleótido según las reivindicaciones 1 a 2 a modo de pareja de hibridación.

6. Utilización según la reivindicación 5, a modo de sonda de hibridación.

7. Utilización según la reivindicación 5, para inactivar la expresión génica en un experimento de cultivo celular.