Un péptido correspondiente al sitio apoptóticamente activo de alfa-fetoproteína humana ubicado en los restos de aminoácidos 251-259 de dicha proteína,

que tiene la secuencia de aminoácidos C*C*RGDVLDC*, en la que los restos marcados como asterisco indican posiciones de posibles puentes disulfuro

Péptido modulador de la activación de caspasa.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a la medicina y a mecanismos de muerte de células humanas y animales. En particular, la invención se refiere a péptidos capaces de inhibir la muerte celular apoptótica inducida por diferentes factores. La invención describe péptidos con dichas actividades y métodos de producción y uso de dichos péptidos.

Antecedentes de la invención

La apoptosis es una forma activa de muerte celular que está implicada en múltiples procesos del desarrollo celular normal, así como en transformaciones de células malignas. El mecanismo de apoptosis está implicado en sucesos biológicos inducidos por diversos tipos de fármacos, citoquinas y factores de crecimiento, estrés oxidativo, radiación, envejecimiento, enfermedades autoinmunes y rechazo inmune en el transplante de órganos. Estudios recientes sobre apoptosis demuestran que se emplean mecanismos moleculares comunes en diversos tipos de apoptosis, inducidos por hormonas, citoquinas, carencia de factor de crecimiento, agentes quimioterapéuticos, radiación ionizante, trastornos inmunológicos, SIDA, cáncer y envejecimiento (Nagata, (1997) Cell 88, 355-365).

La activación similar a una cascada de las proteasas caspasas representa el punto fundamental en la inducción de apoptosis (Cohen, et al. (1997) Biochem. J, 326: 1-16). Se describen dos tipos diferentes de señalización de apoptosis. La fase inicial del desencadenamiento de apoptosis dependiente de receptor incluye la activación de receptores de muerte apropiados mediante ligandos específicos, tales como TNF o FasL, que son actualmente los inductores de apoptosis más estudiados (Wallach et al. (1997). FEBS Letters, 410: 96-106). Después de la activación, los receptores de muerte de la superficie celular, Fas (CD95) o TNFR1, se unen a proteínas adaptadoras citosólicas (FADD, MORT, RIP, TRADD), que, a su vez, reclutan caspasa-8 para activar la cascada de proteasas (caspasas) de la familia de la enzima convertidora de interleuquina-1-ß ICE/CED-3, seguida de la activación de la subfamilia de CPP32/caspasa-3 de cisteína proteasas, cuyos miembros aparecen en el citoplasma celular en forma de precursores latentes, procaspasas (Enari, et al. (1996) Nature 380: 723-726). Los tipos de apoptosis independientes de receptor habitualmente incluyen mecanismos inducibles por el citocromo c de importancia crítica que requieren la formación del complejo terciario del citocromo c, dATP, Apaf-1 y procaspasa-9, que conduce a la activación de la última mediante autoproteolisis y homodimerización, y la posterior activación de la cascada de caspasas (Liu et al. (1996) Cell, 86: 147-157; Pan et. al., (1998) FEBS Letters, 426: 151-154; Slee et al., (1999) J Cell Biol., 144: 281-292).

Los agentes que afectan al control biológico de la apoptosis tienen, por lo tanto, una potencial utilidad terapéutica en numerosas aplicaciones clínicas. Una serie de inhibidores de apoptosis obtenidos de plantas se emplean para seleccionar trastornos patológicos que a menudo acompañan a la quimioterapia, radiación, trastornos inmunes, o SIDA. Estos suplementos contienen generalmente carbohidratos, grasas e hidrolizados de proteínas vegetales, lectinas, y fosfolípidos (US6004579, Barr et al.). Podían emplearse potentes reguladores de apoptosis en el tratamiento de pacientes de cáncer para controlar la terapia con citoquinas, quimioterapia, o radioterapia. Los mecanismos apoptóticos operan en los diversos tipos de trastornos inmunológicos, tales como neoplasias malignas autoinmunes, rechazo inmune en transplante de órganos o anafilaxis, o infecciones víricas por el virus de inmunodeficiencia humana.

La alfa-fetoproteína (AFP) es una glucoproteína fetal asociada a tumores que muestra una amplia gama de actividades biológicas, incluyendo regulación del crecimiento celular, diferenciación de células inmaduras, inmunosupresión de células inmunes activadas, inducción de apoptosis específica de tumores y regulación de señales apoptóticas mediadas por otros factores, así como regulación de diversas expresiones génicas (Deutsch, (1991) Adv. Cancer Res., 56: 253-312; Mizejewsky, (1997) Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 215: 333-362). Múltiples pruebas de actividades reguladoras del crecimiento celular, incluyendo actividad supresora de tumores, se han descrito para diversas especies de molécula de AFP de longitud completa (Semenkova et al., (1997) Tumor Biology, 18: 261-274; Semeniuk et al, (1995) Ad Exper. Med. Biol., 383: 255- 269; Sonnenschein et al., (1980) J Natl Cancer Inst., 64: 1141-1146; Soto et al. , (1980) Proc. Natl Acad. Sci USA, 77: 2084-2087; Jacobson et al., (1999) Cancer Research, 50: 415-420), sus fragmentos proteolíticos (Dudich et al., (1999) Biochemistry, 38: 10406-10414) o dominios recombinantes (Festin et al., (1999) Biochim. Biophys. Acta, 1427: 307-314) y péptidos sintéticos (Mesfin et al., (2000) Biochim. Biophys. Acta, 1501: 33-43; Mizejewsky, et al., (1996) Mol. Cell. Endocr., 118: 15-23 (1996). La búsqueda de la ubicación de sitios activos funcionales de la molécula de AFP que sean responsables de sus múltiples actividades ha sido realizada por diversos investigadores. La ubicación de los sitios de unión de ácido araquidónico y estradiol ha tenido éxito (Deutsch, (1991) Adv. Cancer Res., 56: 253-312; Mizejewski, (1997) Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 215: 333-362; Nishi et al., (1993) Tumor Biol. 14: 234-243).

Recientemente se demostró, que la AFP realiza su actividad supresora de tumores desencadenando apoptosis mediante la activación de caspasa-3 e independientemente de la señalización de Fas/FasL y TNF/TNFR (Dudich et al., (1999) Eur. J Biochem. 266: 1-13; Semenkova et al., (1997) Tumor Biology, 18: 261-274; Dudich et al. (1998) Tumor Biology, 19: 30-40). Se han descrito múltiples pruebas de la supresión del crecimiento de células tumorales mediada por AFP en la última década, pero el sitio activo de la molécula de AFP que es responsable de la señalización de apoptosis no ha sido identificado.

El ADN y las secuencias de aminoácidos de la AFP humana se han descrito (Morinaga, et. al.,"Primary structures of human alpha-fetoprotein and its mRNA" Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 4604-4608 (1983). Péptidos sintéticos, correspondientes al sitio de unión a E2 demostraron poseer actividad supresora de tumores (Patentes de Estados Unidos US5674842; 10/1997 Mizejewsky; US5707963.07/1998 Mizejewsky). Diversas proteínas biológicamente activas comparten una homología de secuencia con AFP (Mizejewsky, (1993) BioEssays, 15: 427-432; Mizejewsky, (1997) Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 215: 333-362). Se ha identificado una auténtica homología de AFP con diversas proteínas, implicadas en la señalización de apoptosis, tales como Bcl2, TNFR1, Fas, etc. (Mizejewsky, (2001) Proc. Soc. Exp. Biol. Med). El documento WO 9835981 A1 (Economou, J. et al., 1998) describe el uso de 66 secuencias peptídicas de AFP que son útiles para inmunización contra el cáncer. Uno de los péptidos, A20, era CRGDVLDCL, que a propósito incluye una parte del sitio activo de AFP, descubierto por la presente invención. Sin embargo, no se descubrió ningún efecto especial del péptido CRGDVLDCL y la presente invención sigue siendo la primera capaz de identificar uno de los supuestos sitios biológicamente activos de AFP. Además, los péptidos de la presente invención incluyen un resto cisteína adicional que permite la formación de puentes disulfuro intercatenarios y producir una actividad biológica significativamente más alta que la secuencia CRGDVLDCL.

Un importante sitio de unión a integrina es un tripéptido Arg-Gly-Asp, que está presente en una serie de ligandos de integrina. Las integrinas son glucoproteínas heterodiméricas que median interacciones célula-matriz y célula-célula y tienen un papel activo en los procesos de diferenciación celular, reconocimiento inmune, desarrollo tumoral y crecimiento metastático. Se han identificado regiones de contacto para la secuencia Arg-Gly-Asp en las subunidades de integrina (véase Pasqualini, et al. "A peptide isolated from phage display libraries is a structural and functional mimic of an Arg-Gly-Asp-binding site on integrins". J Cell Biol. (1995) 130: 1189-1196). Los péptidos sintéticos que contienen el motivo Arg-Gly-Asp se usan como inhibidores de interacciones integrina-ligando (D'Souza et al. (1988) Science, 242: 91-93). Se ha descrito que los péptidos sintéticos que contienen el motivo Arg-Gly-Asp son capaces de dirigir...

1. Un péptido correspondiente al sitio apoptóticamente activo de alfa-fetoproteína humana ubicado en los restos de aminoácidos 251-259 de dicha proteína, que tiene la secuencia de aminoácidos C*C*RGDVLDC*, en la que los restos marcados como asterisco indican posiciones de posibles puentes disulfuro.

2. El péptido de acuerdo con la reivindicación 1, que tiene una estructura lineal.

3. El péptido de acuerdo con la reivindicación 1, que tiene una estructura polimerizada o cíclica.

4. El uso de un péptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, para preparar una preparación para prevenir in vitro la apoptosis de células cultivadas preparadas para fines científicos o técnicos.