PARTICULAS SIMILARES A VIROSOMAS.

Un método para producir una partícula semejante a virosoma que comprende poner en contacto un virus con envoltura con una disolución que contiene un fosfolípido de cadena corta que tiene una concentración micelar crítica (cmc) mayor de 0,

1 mM lo que permite la solubilización de la envoltura viral de dicho virus que comprende además la eliminación de dicho fosfolípido de cadena corta de dicha disolución lo que permite la formación de una envoltura viral reconstituida funcionalmente

Partículas similares a virosomas.

La invención se refiere a la producción de partículas semejantes a virosomas. Las vacunas frente a virus que contienen membranas (con envoltura) consisten principalmente en virus muertos o vivos atenuados, o una preparación de sus proteínas (p. ej. vacunas de virus fraccionados o preparaciones de subunidades). La vacunación con virus muertos y preparaciones de proteínas es más segura que la vacunación con virus vivos atenuados, porque los últimos pueden mutar o revertir de nuevo al virus de tipo salvaje. Las vacunas con subunidades tienen la ventaja clara de que pueden prepararse a partir de proteínas virales expresadas por células en lugar de a partir de virus, lo que hace que la producción sea más segura y elimina el riesgo de contaminar las preparaciones de vacuna con virus vivos. Sin embargo, mientras que la inyección de virus vivos induce generalmente una respuesta inmune fuerte, que protege frente a infecciones futuras con el virus, las preparaciones de proteínas pueden no conseguir esto. Esto se debe a que los virus vivos atenuados infectan las células del cuerpo y se replicarán por estas células en algún grado, después de lo cual las células infectadas y los virus son detectados por las células del sistema inmune, desencadenando una respuesta inmune. Los virus vivos o muertos también pueden ser internalizados por células fagocíticas especializadas del sistema inmune, tales como células dendriticas, y ser presentados a otras células del sistema inmune, desencadenando una respuesta inmune. Estas células fagocíticas patrullan el cuerpo, ingiriendo partículas del tamaño de virus todo el tiempo, pero no internalizan eficazmente las proteínas purificadas de vacunas de virus fraccionados o de subunidades [1,2].

Se han emprendido numerosos intentos para reforzar la respuesta inmune frente a preparaciones de subunidades mediante medios físicos o químicos. El principio más importante que surge de estos experimentos es que se necesita combinar múltiples copias de las proteínas virales en partículas, que serán internalizadas eficazmente por las células fagocíticas. Estas partículas pueden ser partículas semejantes a virosomas, virosomas completos, Complejos Inmunoestimulantes (IS-COM), preparaciones de proteosomas o proteínas en vehículos de microparticulas. Frecuentemente, estas partículas también contienen sustancias químicas con las que se pretende estimular el sistema inmune (denominadas adyuvantes), que están dirigidas a receptores específicos de los fagocitos o las células efectoras del sistema inmune.

Por ejemplo, los ISCOM son partículas semejantes a cestas que contienen proteínas virales formando un complejo con adyuvantes tales como saponinas como Quíl A®), habitualmente aislados de la corteza de Quillaia sopanaría Molina. Mezclados con antígenos, y lípidos tales como colesterol, estos adyuvantes forman las estructuras ISCOM típicas de entre 30-40 nm, haciendo que el antígeno sea suficientemente particulado como para ser internalizado por las células fagocíticas del sistema inmune, actuando al mismo tiempo como un adyuvante. Sin embargo, aunque los ISCOM se han usado en varias vacunas veterinarias, e incrementan fuertemente la inmunogenicidad de las proteínas de la membrana viral, el desarrollo de dichas vacunas para los seres humanos se ha inhibido por las preocupaciones acerca de su toxicidad y la complejidad de la mezcla [3], Un tipo más reciente de partícula, proteosomas (solicitud de EEUU 0010053368) [4], consiste en complejos de proteínas antigénicas tales como la hemaglutinina de influenza o la glicoproteina de la envoltura del virus de inmunodeficiencia humano, mezcladas con las proteínas purificadas de la membrana exterior de bacterias tales como meningococci. Aunque estas múltiples proteínas bacterianas pueden actuar como adyuvantes, la naturaleza compleja de dichas mezclas, que consisten en múltiples proteínas, lípidos y otras sustancias, presentará un problema de normativa. Además, la respuesta inmune está dirigida frente a todas las proteínas y otros antígenos presentes en la disolución, y menos específicamente frente a las proteínas virales.

Una clase particularmente útil de composición de vacuna que se ha desarrollado en la técnica se conoce como "virosomas", que son bicapas lipídicas que contienen glicoproteínas virales obtenidas de virus con envoltura. El concepto de usar dichos virosomas para propósitos de vacunación, particularmente para vacunación frente a influenza, ha sido introducido por Almeida et al. [5], Los virosomas (o partículas semejantes a virosomas, considerando que el tamaño y la forma exactos de las partículas es menos importante que el hecho de que retenga su naturaleza particulada y la actividad de fusión de membranas funcional y biológicamente relevante) se producen generalmente por extracción de las proteínas y lípidos de membrana de virus con envoltura con un detergente, seguido de la eliminación de este detergente de los lípidos y las proteínas de membrana virales extraídos, de hecho reconstituyendo o reformando las bicapas lipídicas características (envolturas) que rodean el núcleo viral o nucleocápside [5].

El virus influenza y el virus del Bosque de Semilki (SFV) son dos ejemplos clásicos de virus con envoltura. La primera etapa en la infección de las células por estos virus es la internalización de las partículas virales intactas por endocitosis mediada por receptor. En el interior del compartimento endosomal las condiciones son ligeramente ácidas debido a la actividad de una bomba de protones de membrana dependiente de ATP. En estas condiciones (pH 5-6), las proteínas virales que forman espículas experimentan un cambio conformacional que resulta en el desencadenamiento de la actividad viral de fusión de membranas. La fusión posterior de la membrana viral con la del endosoma resulta en la penetración citoplásmica del genoma viral, y la célula puede considerarse infectada [6].

Los virus con envoltura portan en general proteínas de membrana específicas (las "espículas") que se requieren para la unión y la entrada a las células. Por ejemplo, los virus influenza portan aproximadamente 500 copias de hemaglutinina (HA), que está compuesta por dos subunidades unidas por disulfuro, HA1 y HA2, y que forma trímeros en la membrana viral [7], Las subunidades HA1 forman el dominio superior de la espícula y portan un bolsillo responsable de la unión del virus a su receptor de la membrana plasmática, lípidos sialilados (gangliósidos) y proteínas. La región del tallo de la espícula está compuesta principalmente por las tres subunidades HA2. Cada subunidad HA2 contiene un péptido de fusión N-terminal, una secuencia apolar altamente conservada. Después del cambio conformacional inducido por la exposición al pH ligeramente ácido estos péptidos interaccionan con la membrana diana dando lugar a la fusión [6].

Aunque tanto SFV corno influenza entran en las células a través de endocitosis mediada por receptor y fusión en los endosomas ácidos, los mecanismos moleculares de la fusión de membranas mediada por los virus SFV e influenza son bastante diferentes. Cada virión de Bosque de Semliki contiene 80 espículas, que están compuestas cada una por tres heterodímeros E1/E2 [8], Estas dos proteínas de membrana tienen funciones separadas durante el ciclo de vida viral. Así, mientras E2 está implicada en la unión virus-receptor, E1 medía la fusión de las membranas virales y endosomales. Después de la acidificación, el complejo E1/E2 se disocia y E1 se reorganiza para formar homotrimeros, y mientras que HA de influenza tiene un péptido de fusión N-terminal bien definido, E1 no. Otra diferencia prominente entre ambos virus es que la fusión mediada por HA no es muy sensible a la composición lipídica de la membrana diana [9], La fusión de SFV tiene un requerimiento estricto de presencia de colesterol [11-12] y esfingolípidos [13-17] en la membrana diana.

Una característica esencial de las partículas semejantes a virosomas obtenidas por reconstitución (también llamadas virosomas en la presente memoria) es que son partículas con el tamaño que es internalizado eficazmente por las células fagocíticas del sistema inmune y mimetizan en gran medida la composición, arquitectura superficial y actividades funcionales de la envoltura viral nativa. Se encontró que los virosomas que son particularmente activos en la inducción de una respuesta inmune mantenían las funciones apropiadas de las proteínas de la envoltura del virus nativo, tales como fusión de membranas, unión al receptor y otras actividades. La conservación de la actividad de unión al receptor y de...

1. Un método para producir una partícula semejante a virosoma que comprende poner en contacto un virus con envoltura con una disolución que contiene un fosfolípido de cadena corta que tiene una concentración micelar crítica (cmc) mayor de 0,1 mM lo que permite la solubilización de la envoltura viral de dicho virus que comprende además la eliminación de dicho fosfolípido de cadena corta de dicha disolución lo que permite la formación de una envoltura viral reconstituida funcionalmente.

2. Un método según la reivindicación 1 que comprende además la eliminación de la nucleocápside viral de dicha disolución.

3. Un método según la reivindicación 1 ó 2 en el que dicho fosfolípido se elimina por diálisis o filtración.

4. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en el que dicho fosfolípido es una fosfatidilcolina.

5. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en el que dicho fosfolípido comprende 1,2-diheptanoil-sn-fosfatidilcolina ó 1,2-dicaproil-sn-fosfatidilcolina.

6. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en el que dicho virus comprende un virus influenza o un alfavirus.

7. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 que comprende además la adición de una molécula que no se obtiene de dicho virus a dicha partícula semejante a virosoma.

8. Un método según la reivindicación 7 en el que dicha molécula comprende un lípido o una proteína.

9. Un método según la reivindicación 7 u 8, en el que dicha molécula es anfifílica.

10. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9 en el que dicha molécula se obtiene de un patógeno.

11. Un método según la reivindicación 10 en el que dicho patógeno es un virus, una bacteria o un parásito.

12. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9 en el que dicha molécula comprende un antígeno específico de tumores.