OBTENCION Y EMPLEO DE GENOTECAS DE ANTICUERPOS HUMANOS ("BANCOS DE ANTICUERPOS HUMANOS").

Procedimiento para la obtención de bibliotecas de anticuerpos humanos;

caracterizado porque se aísla el ARNm a partir de linfocitos B humanos periféricos, no activados y se transcribe en el ADNc, a continuación se amplifica el ADNc, que codifica anticuerpos, por medio de una reacción en cadena de polimerasa RCP con ayuda de cebadores adecuados, llevándose a cabo a continuación una incorporación en plásmidos de expresión adecuados y a continuación se lleva a cabo la expresión del anticuerpo-ADNc en clones individuales, caracterizado porque la maqueta de los cebadores para la reacción inversa para la síntesis de la hebra, no codificante, del ADN de la cadena pesada está basada en secuencias de IgM y porque se posibilita, por medio del empleo de diversos cebadores para la síntesis de la hebra, no codificante, la obtención de un tipo de anticuerpo, que está constituido por los dominios variables y por los primeros dominios constantes

Obtención y empleo de genotecas de anticuerpos humanos (bancos de anticuerpos humanos).

La invención se refiere a la obtención y al empleo de genotecas de anticuerpos humanos (AK). A partir de una mezcla de linfocitos B humanos se traduce su ARNm en ADNc mediante el empleo de oligo-dT-cebadores. A continuación tiene lugar una amplificación de los ADNc específicos de los AK mediante una reacción en cadena de polimerasa (RCP, Polymerase Chain Reaction) con utilización de secuencias cebadoras de oligonucleótidos adecuadas. Por medio de la expresión de estos ADNc amplificados, específicos de los AK, en un vector de expresión bacteriano, por ejemplo en un vector pFMT, que se describe a continuación, en E. coli, está disponible, por lo tanto, una biblioteca de anticuerpos humanos con un amplio repertorio para llevar a cabo la exploración (screenen) con antígenos seleccionados in vitro.

Se estima que el sistema inmune de los seres humanos, o bien de los mamíferos, tiene entre 10⁶ y 10⁸ anticuerpos diferentes. Este número de anticuerpos es suficiente para generar una reacción inmune del cuerpo tanto contra todos los antígenos que existen en la naturaleza así como, también, contra los antígenos sintéticos. Si se tiene en consideración así mismo que con frecuencia varios anticuerpos reaccionan con el mismo antígeno, se establece el repertorio de los anticuerpos realmente diferentes más bien en el intervalo comprendido entre 10⁶ y 10⁷.

Hasta el presente han sido obtenidos los anticuerpos específicos siempre a partir de una inmunización con el antígeno correspondiente, por ejemplo por medio de una inyección del antígeno en el organismo o por medio de una incubación de células del bazo in vitro con estos antígenos. En el caso de los anticuerpos policlonales pueden aislarse a continuación las inmunoglobulinas a partir del suero y a partir de las mismas pueden obtenerse los anticuerpos específicos por ejemplo por medio de procedimientos de absorción. Los anticuerpos monoclonales son aislados a partir de los sobrenadantes celulares o bien a partir del lisado celular de las células tumorales del bazo (células de hibridoma) clonadas, fusionadas con linfocitos B individuales. Los procedimientos que han sido citados precedentemente no son adecuados, de manera especial, para la obtención de anticuerpos humanos específicos o bien de anticuerpos monoclonales humanos.

La presente invención se plantea por consiguiente la tarea de desarrollar un método accesible en general para la generación de anticuerpos monoclonales humanos específicos (huMAK's) o de fragmentos de anticuerpos, que contengan los puntos de enlace con el antígeno.

Se ha encontrado que los huMAK's buscados o sus fragmentos, que contienen los dominios variables, que se enlazan con los antígenos, pueden ser aislados a partir de genotecas de inmunoglobulina humana. En primer lugar se partió de una mezcla de linfocitos B humanos no activados cuyo ARNm es aislado y es traducido en ADNc con ayuda de oligo-dT-cebadores. Una amplificación específica de la población de anticuerpos ADNc dentro del conjunto de ADNc obtenido se consiguió por medio de la utilización de la RCP. Con esta finalidad se emplearon determinados oligonucleótido-cebadores, que son homólogos con respecto a las secuencias conservadas sobre ambos extremos del anticuerpo-ADNc (véase más adelante y los ejemplos). La maqueta del cebador para la reacción inversa para la síntesis de la hebra no codificante del ADN de la cadena pesada está basada en secuencias IgM (subclase III, puesto que ésta abarca la mayoría de las secuencias IgM). Las moléculas IgM están presentes en los linfocitos B no activados con mayor frecuencia que todas las otras clases de inmunoglobulinas. Las secuencias de IgG son preponderantes, por el contrario, en los linfocitos B activados, cuyo repertorio de anticuerpos diferentes es mucho menor. En el caso de una biblioteca IgG existiría por otra parte el peligro de que dominase en la biblioteca un IgG expresado de forma especialmente intensa o un número reducido de los mismos.

Se llevaron a cabo, de manera conveniente, hasta 30 episodios de amplificación. Los oligonucleótidos-cebadores contienen puntos de restricción adecuados con objeto de insertar el ADN amplificado por ejemplo en el plásmido de expresión del anticuerpo pFMT (véase más adelante). Este plásmido de expresión posibilita la expresión de anticuerpos-ADNc y a continuación la secreción de los productos de expresión en bacterias (E. coli). El anticuerpo-operón del plásmido contiene las secuencias de los fragmentos variables tanto de las cadenas pesadas así como, también, de las cadenas ligeras de un anticuerpo. Las secuencias conductoras adecuadas procedentes del fragmento aminoterminal de una proteína bacteriana posibilitan la secreción de los fragmentos de anticuerpo. Las secuencias conductoras son escindidas durante la secreción por un enzima bacteriano. Durante la secreción de los productos anticuerpos-ADNc se asocian las cadenas ligeras y las cadenas pesadas del anticuerpo (con o sin dominios constantes limítrofes). De este modo, se forma un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo, que contiene un punto funcional de enlace con el antígeno. De la misma manera, han sido descritos por otros autores constructos similares para anticuerpos individuales (Better et al. (1988), Science 240, 1041, y Skerras & Plückthun (1988), Science 240,1038).

La amplificación del ADN, que codifica fragmentos variables de anticuerpos, ha sido descrita ciertamente por otros autores (Orlandi et al. (1989), Proc. Nati. Acad. Sci. 86, 3833; Sastry et al., (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. 86, 5728; Ward et al. (1989), Nature 341, 544); Huse et al. (1989), Science 246, 275). Sin embargo se aisló en este caso el ARNm, que codifica entre otras cosas también anticuerpos, a partir de células de hibridoma o de linfocitos del bazo después del tratamiento con un antígeno determinado. Por consiguiente se emplearán en aquél caso también secuencias cebadoras que únicamente están basadas en secuencias IgG. Naturalmente en aquél caso es ventajoso para buscar el mayor número posible de clones de anticuerpo-ADN, que procedan de linfocitos activados. Con cebadores procedentes de secuencias IgG son mucho mayores las probabilidades de encontrar clones, que contengan ADN codificadores de anticuerpos contra el antígeno inyectado. Así mismo debe añadirse que en los trabajos existentes han sido sintetizados anticuerpos-ADN murinos y, por consiguiente no humanos y que han sido amplificados además con exclusión de las regiones de la cadena lambda.

En la presente invención son utilizadas, por el contrario, secuencias cebadoras que son homologas con respecto a las secuencias de los dominios constantes del IgM-ADNc. De este modo la invención puede ser realizada del mejor modo posible, es decir que puede ponerse a disposición una gran variedad de anticuerpos, concretamente todo el repertorio de anticuerpos, en forma de una biblioteca. La expresión preferentemente en E. coli proporciona entonces la biblioteca de anticuerpos humanos buscada, en la que se encuentran los anticuerpos humanos buscados o bien los fragmentos de los anticuerpos mediante exploración de los clones bacterianos con el antígeno elegido.

En la tabla 1 se han reunido oligonucleótidos cebadores adecuados para llevar a cabo la amplificación. Las posiciones de los cebadores, precedentemente citados, sobre las cadenas µ, kappa y lambda se han representado esquemáticamente en la tabla 2. En los ejemplos siguientes se han descrito las construcciones biológicas moleculares en detalle, entre las cuales también se encuentra el vector de expresión, es decir el plásmido de expresión del anticuerpo pFMT. La invención se refiere, por consiguiente, a bibliotecas de anticuerpos humanos preparadas mediante transcripción del ARNm a partir de linfáticos B humanos no activados (periféricos) por medio de oligo-dT-ceb adores, seguido de una amplificación por medio de una RCP con utilización de secuencias, que contienen cebadores, homologas con respecto a las regiones conservadas de IgM-ADNc y a continuación incorporación en un plásmido de expresión adecuado para llevar a cabo la expresión en microorganismos, preferentemente en el vector de expresión pFMT para llevar a cabo la expresión en E. coli. En una forma preferente de realización se incorpora, además, una secuencia, que codifica un péptido marcador, por ejemplo una secuencia TAG de tal manera que los productos de la expresión...

1. Procedimiento para la obtención de bibliotecas de anticuerpos humanos; caracterizado porque se aísla el ARNm a partir de linfocitos B humanos periféricos, no activados y se transcribe en el ADNc, a continuación se amplifica el ADNc, que codifica anticuerpos, por medio de una reacción en cadena de polimerasa RCP con ayuda de cebadores adecuados, llevándose a cabo a continuación una incorporación en plásmidos de expresión adecuados y a continuación se lleva a cabo la expresión del anticuerpo-ADNc en clones individuales, caracterizado porque la maqueta de los cebadores para la reacción inversa para la síntesis de la hebra, no codificante, del ADN de la cadena pesada está basada en secuencias de IgM y porque se posibilita, por medio del empleo de diversos cebadores para la síntesis de la hebra, no codificante, la obtención de un tipo de anticuerpo, que está constituido por los dominios variables y por los primeros dominios constantes.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la expresión se lleva a cabo en el plásmido pFMT de conformidad con la tabla 6.

3. Procedimiento para el aislamiento de fragmentos de anticuerpos humanos específicos, caracterizado porque se exploran bibliotecas de anticuerpos humanos, preparados según la reivindicación 1 o 2, con antígenos específicos.