Un método de inhibición selectiva del crecimiento de células no-diana en una población mixta de células diana y células no-diana,

comprendiendo el método los pasos de: (a) poner en contacto la población mixta con un agente selectivo que comprende un resto portador enlazado a un resto tóxico; en donde el agente selectivo comprende un residuo de aminoácido enlazado por un eslabón de enlace peptídico fácilmente escindible a un resto tóxico o comprende un azúcar enlazado en N por un eslabón disociable por glicosidasa a un resto tóxico; comprendiendo dicho resto tóxico un ácido 1-aminoalquil-fosfónico o una sal del mismo; en donde el agente selectivo es capaz de entrar en células no-diana en las cuales el eslabón fácilmente escindible está disociado, liberando el resto tóxico para ejercer un efecto tóxico sobre las células no-diana, causando la inhibición del crecimiento de las células no-diana, en tanto que el agente selectivo es incapaz de acumularse a concentración tóxica en las células diana y/o el eslabón fácilmente escindible no está disociado en las células diana y/o el resto tóxico, si es liberado por el agente selectivo, no ejerce un efecto tóxico sobre la célula diana; y (b) cultivar las células en condiciones que permiten el crecimiento de las células no inhibidas, en donde la población mixta de células comprende bacterias, células de levadura y células fúngicas

Mejoras en o relativas a agentes selectivos para cultivos biológicos.

Campo de la invención

Esta invención se refiere a un método de inhibición selectiva del crecimiento de ciertas células en una población mixta y un kit para realización del método.

Antecedentes de la invención

Se conocen muchos agentes selectivos que, cuando se incorporan en medios de crecimiento biológicos, permiten el crecimiento preferencial (es decir la selección) de organismos particulares, especialmente en bacterias particulares. Es bien conocido, por ejemplo, cuando se realiza una transformación bacteriana, incorporar un gen de resistencia a los antibióticos en el DNA transformante, y exponer subsiguientemente la población mixta de células transformadas y no transformadas al antibiótico relevante, inhibiendo con ello el crecimiento de las células no transformadas y seleccionando las células transformadas.

Igualmente, es conocida la utilización de diversas sustancias colorantes o sales para seleccionar un organismo particular (v.g. un patógeno) en una población mixta de bacterias presentes en una muestra obtenida de un individuo humano o animal, como ayuda para la diagnosis de enfermedades infecciosas. Sin embargo, se sabe que estos agentes selectivos inhiben el crecimiento de células sanas (Vassiliadis et al., 1974 J. Appl. Bacteriol. 37, 411-418) y restringen la recuperación de las células lesionadas (Kang & Siragusa 1999, Appl. and Env. Microbiol. 65, 5334-5337). Esto es una severa desventaja, dado que en muchas aplicaciones prácticas, se desea recuperar organismos que están lesionados o "estresados" (v.g. cuando se intentan recuperar patógenos de muestras de alimentos) debido a la exposición a condiciones sub-óptimas (de temperatura, pH, o análogas).

Allen et al. (1978, Nature 272, 56-58) describieron que los fosfonopéptidos poseían propiedades antibacterianas. En particular, se demostró que el compuesto ácido L-alanil-L-1-aminoetilfosfónico (denominado "alafosfina") era un agente antibacteriano potente que se creía causaba la inhibición de la síntesis de peptidoglicanos. La alafosfina está compuesta por el estereoisómero L de alanina acoplado a ácido L-1-aminoetilfosfónico (AEP), condensándose el grupo -COOH de la alanina y el grupo amino de AEP para formar un enlace peptídico. Estos descubrimientos originales fueron desarrollados ulteriormente por Atherton et al., (1979) Antimicrob. Agents and Chemother. 15, 677-683) y por Allen et al., (1979), Antimicrob. Agents and Chemother. 16, 306-313). Sin embargo, la alafosfina no fue nunca adoptada ampliamente como antibiótico, y no fue propuesta para uso como agente selectivo. En particular, se pretende generalmente que los antibióticos sean de "amplio espectro", a fin de destruir una gran diversidad de bacterias, lo que hace que su uso sea improbable como agentes selectivos en microbiología de diagnóstico.

Sumario de la invención

En un primer aspecto, la invención proporciona un método de inhibición selectiva del crecimiento de células no-diana en una población mixta de células diana y no-diana, comprendiendo el método los pasos de: (a) poner en contacto la población mixta con un agente selectivo que comprende un resto portador enlazado a un resto tóxico; en donde el agente selectivo comprende un residuo de aminoácido enlazado por un eslabón de enlace peptídico fácilmente escindible a un resto tóxico o comprende un azúcar enlazado en N por un eslabón disociable por glicosidasas a un resto tóxico; comprendiendo dicho resto tóxico un ácido 1-aminoalquil-fosfónico o una sal del mismo; en donde el agente selectivo es capaz de entrar en las células no-diana en las cuales el eslabón fácilmente escindible está disociado, liberando el resto tóxico para ejercer un efecto tóxico en las células no-diana, causando la inhibición del crecimiento de las células no-diana, en tanto que el agente selectivo es incapaz de acumularse a concentración tóxica en las células diana y/o el eslabón fácilmente escindible no está disociado en las células diana y/o el resto tóxico, si se libera del agente selectivo, no ejerce un efecto tóxico sobre la célula diana; y (b) cultivar las células en condiciones que permiten el crecimiento de las células no inhibidas, en donde la población mixta de células comprende bacterias, células de levadura, o células fúngicas.

Las células pueden ser células fúngicas o células de levadura, pero más típicamente serán células bacterianas. En particular, las células diana y no-diana comprenderán ambas normalmente bacterias, y ventajosamente la célula diana puede ser un organismo Gram-negativo (v.g. Salmonella spp.) y las células no-diana comprenderán también organismos Gram-negativos (v.g. E. coli).

Las células diana serán típicamente las de un organismo cuya presencia se desea detectar entre la población mixta. Por ejemplo, las células diana pueden ser una especie o género patógeno particular, mientras que las células no-diana (que no son de interés) pueden ser células representativas de la flora intestinal o de la piel normal de un individuo, del cual se ha obtenido una muestra que contiene la población mixta. Alternativamente, la muestra puede ser, por ejemplo, una muestra de un alimento o bebida para consumo humano o animal. Típicamente, las células no-diana estarán presentes en mayores números que las células diana, por lo que puede ser deseable inhibir selectivamente el crecimiento de las células no-diana a fin de facilitar la detección de las célula diana, que en caso contrario tenderían a verse excesivamente sobrepasadas y enmascaradas así por las células no-diana. Esto tiene una importancia particular durante el pre-enriquecimiento en el cual es posible que la célula diana pueda estar lesionada o estresada y sufra una fase de retardo prolongada a medida que la célula repara cualquier lesión sufrida durante la fabricación o preparación de los alimentos. Una proporción de la población total de competidores no sufrirá lesión alguna y no entrará en fase de retardo cuando se inocula en el caldo pre-enriquecimiento. Éstos pueden crecer rápidamente y debido a un mecanismo conocido como el efecto Jameson (Jameson 1962, J. Hygiene Cambridge 60, 193-207), pueden prevenir el crecimiento de la célula diana antes que la misma haya salido de la fase de retardo y comenzado a multiplicarse. Esto puede limitar gravemente la probabilidad de detección de la célula diana durante el sub-cultivo subsiguiente.

Por lo que antecede, será evidente que puede existir más de una base para la selectividad del agente selectivo, una o más de las cuales pueden operar para una combinación particular agente selectivo/población mixta. Una base de la selectividad (que puede emplearse aisladamente o, más preferiblemente, en asociación con otra base de selectividad) es la de la captura selectiva por células no-diana, de tal modo que el agente selectivo se acumula en las células no-diana pero no se acumula a concentración tóxica en las células diana. Una captura convenientemente selectiva puede alcanzarse haciendo uso de mecanismos de captura (especialmente enzimas de captura tales como permeasas) operativos en la célula no-diana pero que no están presentes en la célula diana. En una realización conveniente, el agente selectivo entra en las células no-diana por medio de una dipéptido-, tripéptido- u oligopéptido-permeasa. Así, el agente selectivo puede comprender deseablemente un resto portador que es procesado eficientemente por un mecanismo de captura en las células no-diana.

Otra base de la selectividad (que puede emplearse aisladamente o en combinación con una base diferente) comprende el uso de un agente selectivo que tiene un eslabón fácilmente escindible que puede ser disociado por las células no-diana pero no es disociable por las células diana. Convenientemente, la disociación del eslabón fácilmente escindible es efectuada por una enzima o combinación de enzimas expresadas por las células no-diana pero no por las células diana.

En ciertas realizaciones, el eslabón fácilmente escindible comprende deseablemente un enlace peptídico, disociable por una peptidasa (preferiblemente una aminopeptidasa) expresada por las células no-diana pero no por las células diana. Típicamente, el enlace peptídico estará formado por el grupo a-COOH de un aminoácido o análogo de aminoácido, pero es posible que el enlace peptídico pueda estar formado por un grupo ß-COOH (v.g. ácido aspártico) o grupo d-COOH (v.g. ácido glutámico).

Ventajosamente, el agente selectivo comprende uno o más residuos...

1. Un método de inhibición selectiva del crecimiento de células no-diana en una población mixta de células diana y células no-diana, comprendiendo el método los pasos de: (a) poner en contacto la población mixta con un agente selectivo que comprende un resto portador enlazado a un resto tóxico; en donde el agente selectivo comprende un residuo de aminoácido enlazado por un eslabón de enlace peptídico fácilmente escindible a un resto tóxico o comprende un azúcar enlazado en N por un eslabón disociable por glicosidasa a un resto tóxico; comprendiendo dicho resto tóxico un ácido 1-aminoalquil-fosfónico o una sal del mismo; en donde el agente selectivo es capaz de entrar en células no-diana en las cuales el eslabón fácilmente escindible está disociado, liberando el resto tóxico para ejercer un efecto tóxico sobre las células no-diana, causando la inhibición del crecimiento de las células no-diana, en tanto que el agente selectivo es incapaz de acumularse a concentración tóxica en las células diana y/o el eslabón fácilmente escindible no está disociado en las células diana y/o el resto tóxico, si es liberado por el agente selectivo, no ejerce un efecto tóxico sobre la célula diana; y (b) cultivar las células en condiciones que permiten el crecimiento de las células no inhibidas, en donde la población mixta de células comprende bacterias, células de levadura y células fúngicas.

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el resto tóxico, cuando es liberado por el agente selectivo, tiene una densidad de carga alta, es decir un coeficiente de reparto log octanol/agua negativo.

3. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en donde las células no-diana poseen una peptidasa que es capaz de escindir el eslabón fácilmente escindible, peptidasa que no está presente en las células diana.

4. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el resto tóxico comprende un residuo de aminoácido y/o un análogo de residuo de aminoácido.

5. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el resto tóxico comprende un grupo C_1-4 alquilo.

6. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el resto tóxico comprende ácido aminoetil-fosfónico o una sal del mismo.

7. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el resto portador comprende un residuo L-alanina o un residuo de ácido L-piroglutámico.

8. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde tanto las células diana como las células no-diana son bacterias.

9. Un método de acuerdo con la reivindicación 8, en donde tanto las células diana como las células no-diana son bacterias Gram-negativas.

10. Un método de acuerdo con la reivindicación 8 ó 9, en donde las células diana son Salmonella spp. y las células no-diana son E. coli y/u otras bacterias coliformes.

11. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el agente selectivo, incorporado en un medio, inhibe el crecimiento de las células no-diana, pero es esencialmente no inhibidor para las células diana tanto si están estresadas como si no lo están.

12. Un kit para uso en un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, que comprende un medio para inhibición selectiva de células no-diana en una población mixta de células no-diana y células diana que comprenden bacterias, células de levadura o células fúngicas, comprendiendo el medio un agente selectivo que comprende un resto portador enlazado a un resto tóxico, en donde el agente selectivo comprende un aminoácido enlazado por un eslabón de enlace peptídico fácilmente escindible a un resto tóxico, o comprende un azúcar enlazado en N por un eslabón disociable por glicosidasa a un resto tóxico; comprendiendo dicho resto tóxico un ácido 1-aminoalquil-fosfónico o una sal de mismo o ingredientes para preparar el mismo; e instrucciones para realizar el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11.