Medio para el cultivo de enterococos resistentes a la vancomicina que comprende:

(i) un medio nutritivo con una fuente energética efectiva para sustentar el crecimiento y la reproducción de los enterococos resistentes a la vancomicina;

(ii) una cantidad efectiva de uno o más agentes selectivos para inhibir el crecimiento de los microorganismos diferentes de los enterococos resistentes a la vancomicina, de manera que dichos agentes selectivos incluyen al menos un antibiótico glicopeptídico;

(iii) un intermedio del ciclo de Krebs, de manera que incluya un ácido α-cetoglutárico y/o sales del mismo, que el medio contenga adicionalmente un primer substrato cromógeno con un grupo fosfato - como substrato para un enzima fosfatasa producido por una primera especie de enterococo resistente a la vancomicina - y que dicho primer substrato cromógeno produzca una primera señal detectable en presencia de dicha primera especie de enterococo resistente a la vancomicina.

Medio para detectar y diferenciar enterococos resistentes a la vancomicina.

La presente invencion se refiere a un medio para el crecimiento y/o la identificacion de microorganismos y a un metodo de identificacion de microorganismos mediante el uso del mismo. Mas concretamente, la presente invencion se refiere a un medio para detectar y diferenciar cepas bacterianas distintas, que es particularmente aplicable - pero no esta de ningun modo limitado - a medios para detectar y diferenciar distintas cepas de enterococos resistentes a la vancomicina y a metodos para su diferenciacion e identificacion.

La deteccion e identificacion de microorganismos es muy importante en varios campos, tales como la diagnosis de enfermedades infecciosas, el rastreo de brotes de enfermedad o de contaminacion, y la deteccion y rastreo de la propagacion de la resistencia a los antibioticos, etc.

En los ultimos aros se han establecido muchos metodos de deteccion e identificacion de microorganismos, usando tecnicas sofisticadas tales como la PCR y analogas. Aunque estos metodos pueden ser muy rapidos y sensibles, todavia hay necesidad de metodos mas tradicionales que implican el cultivo de organismos en medios (solidos, especialmente) . Estos metodos tradicionales tienen la gran ventaja de que aislan los organismos interesantes en forma viable y luego pueden subcultivarse en otros medios y/o analizarse.

En humanos y en muchos otros mamiferos suele haber enterococos en la cavidad oral y en el tracto gastrointestinal, aunque normalmente en concentraciones inferiores a las de la E. coli. Los enterococos crecen a menudo como pares de cadenas y en cultivo pueden prosperar en presencia de sales biliares o de azida sodica a concentraciones que inhiben las bacterias coliformes y muchas bacterias Gram-negativas. Los enterococos han presentado con frecuencia resistencia a ciertos antibioticos, incluyendo la penicilina y los aminoglicosidos, siendo la vancomicina, un antibiotico glicopeptidico, el antibiotico elegido para tratar pacientes con infecciones enterococicas.

En las dos ultimas decadas se ha incrementado la resistencia adquirida a los glicopeptidos en las poblaciones de enterococos. En particular los enterococos resistentes a la vancomicina (ERV) se han relacionado con elevadas tasas de mortalidad y son una forma comun de infeccion en las unidades hospitalarias de cuidados intensivos. En concreto, la resistencia adquirida, codificada por genes vanA o vanB, se considera una seria amenaza para la salud, ya que estos genes pueden transferirse mediante plasmidos y transposones a otras bacterias patogenas, incluyendo los estafilococos. La resistencia adquirida esta asociada con E. faecalis y E. faecium, mientras que E. casseliflavus y

E. gallinarum expresan en general un tipo de resistencia no transferible o intrinseca codificada por genes vanC. Por otra parte el E. faecalis y el E. faecium, ya sean sensibles o resistentes a la vancomicina, muestran diferencias de sensibilidad a otros antibioticos. Por consiguiente la deteccion de enterococos y la diferenciacion de especies es importante para determinar las terapias de tratamiento y control de infecciones con antibioticos.

Para detectar ERV se han desarrollado varios medios de cultivo. Uno de estos medios es agar bilis esculina con vancomicina (BEAv) . Los enterococos hidrolizan el glicosido, esculina, formando dextrosa y esculitina. La esculitina reacciona en el medio con citrato ferrico o con otros iones ferrosos, formando un anillo marron oscuro o negro de compuestos fenolicos alrededor de cada colonia. Se araden sales biliares para inhibir el crecimiento de bacterias Gram-positivas (distintas de los estreptococos del grupo D) y se incluye azida sodica para inhibir el crecimiento de bacterias Gram-negativas. El BEAv permite detectar enterococos pero no diferenciar especies, ya que todos los enterococos son capaces de hidrolizar esculina.

Por tanto se conocen medios para cultivar y detectar enterococos en general y tambien para detectar enterococos resistentes a la vancomicina (ERV) en particular. No obstante los ERV suelen crecer poco en estos medios y las colonias resultantes son pequeras y pueden tardar 48 horas o mas en desarrollarse.

Ademas la mayoria de medios conocidos no distingue entre especies. Casi todo el estado tecnico anterior revela substratos que utilizan sustancialmente todas las especies de enterococos. La distincion de especies es importante por varias razones. En primer lugar el E. gallinarum y el E. casseliflavus tienen en general una forma no transmisible de resistencia a la vancomicina (codificada por el gen vanC) que es de poca importancia clinica, mientras que, en cambio, el E. faecium y el E. faecalis tienen en general una forma transmisible de resistencia que es capaz de pasar a otros patogenos mas agresivos, como los estafilococos. En segundo lugar el E. faecium y el E. faecalis difieren en su sensibilidad a otros antibioticos (cuando la vancomicina deja de ser una opcion debido a su resistencia) y por tanto, para tratar eficazmente un paciente y detener la propagacion de ERV es importante distinguir entre estas dos especies, a fin de determinar la terapia antibiotica apropiada.

La patente U.S. n° 5, 620, 865, de Chen y otros, revela un medio para cultivar y detectar enterococos en 24 horas. El medio esta basado en una formula que comprende un indicador de nutrientes, el cual libera un segmento de nutriente en presencia de enzima º-glucosidasa, que es universal para todas las especies de enterococos y por lo tanto no permite identificarlas.

La patente U.S. 6, 355, 449, de Chen y otros, revela un medio, calificado como mejorado, para detectar la presencia de ERV, que comprende vancomicina, uno o mas agentes selectivos para suprimir el crecimiento de hongos y bacterias no deseados, un primer indicador de nutrientes que proporciona una primera seral detectable cuando es partido por una -glucosidasa y un segundo indicador de nutrientes que produce una molecula intermedia cuando es partido por pirrolidonil arilamidasa, de modo que la molecula intermedia proporciona una segunda seral detectable al reaccionar con un agente revelador. Como alternativa el segundo indicador de nutrientes puede proporcionar una segunda seral detectable al ser partido por pirrolidonil arilamidasa. Como la -glucosidasa es comun a todas las especies de enterococos y por tanto tambien esta presente en otras varias bacterias, incluyendo Listeria, Klebsiella, y Enterobacter, se emplea un segundo enzima comun a los enterococos para aumentar la probabilidad de que todos los microorganismos identificados sean enterococos. Sin embargo el empleo de dos enzimas diferentes revelado por Chen y otros no distingue entre especies de ERV.

La patente US-5, 536, 645 revela un medio nutritivo esencialmente sintetico para microorganismos.

La patente US-5, 786, 167 revela un medio de cultivo y un metodo para distinguir bacterias de la especie Salmonella de otras bacterias gram-negativas.

El International Journal of Food Microbiology [Revista internacional de microbiologfa alimentaria] (volumen 88, n° 2-3, (2003) p. 147-164) revela metodos para aislar, contar, caracterizar e identificar especies de enterococos, incluyendo medios de separacion y recuento.

La revista Clinical infectious Diseases [Enfermedades infecciosas clfnicas] 2006:42 (suplemento 1) S25-S34 revela la resistencia a la vancomicina en cocos gram-positivos, incluyendo el mecanismo de resistencia.

Un producto comercial para cultivar ERV se suministra con la marca CHROMagar® medium VRE (de CHROMagar Microbiology, Paris, Francia) . El medio emplea dos substratos cromogenos y es capaz de distinguir E. faecalis y E. faecium de E. gallinarum y E. casseliflavus, pero no E. faecalis de E. faecium.

Otro producto comercial, el chromlD® VRE (de bioMerieux, Francia) , es un medio nutriente solido que comprende vancomicina (8 mg/l) y dos substratos cromogenos, uno hidrolizado por a-glucosidasa y otro por -galactosidasa, y es teoricamente capaz de distinguir entre E. faecalis y E. faecium. Sin embargo a las 24 horas la mayor parte de las colonias son pequeras y dificiles de observar visualmente, si la muestra original solo contenia un pequero numero de enterococos. Ademas el crecimiento de ERV a partir de genes vanB es escaso debido a la alta concentracion de (8 mg/l) . Como el vanB produce una forma transmisible de resistencia a la vancomicina, es importante poder cultivar ERV vanB. Ademas el color de las colonias de E. faecalis cultivadas en este medio es con frecuencia inconsistente, lo cual... [Seguir leyendo]

REIvINDICaCIoNES

1. Medio para el cultivo de enterococos resistentes a la vancomicina que comprende:

(i) un medio nutritivo con una fuente energetica efectiva para sustentar el crecimiento y la reproduccion de los enterococos resistentes a la vancomicina;

(ii) una cantidad efectiva de uno o mas agentes selectivos para inhibir el crecimiento de los microorganismos diferentes de los enterococos resistentes a la vancomicina, de manera que dichos agentes selectivos incluyen al menos un antibiotico glicopeptidico;

(iii) un intermedio del ciclo de Krebs, de manera que incluya un acido a-cetoglutarico y/o sales del mismo, que el medio contenga adicionalmente un primer substrato cromogeno con un grupo fosfato - como substrato para un enzima fosfatasa producido por una primera especie de enterococo resistente a la vancomicina - y que dicho primer substrato cromogeno produzca una primera seral detectable en presencia de dicha primera especie de enterococo resistente a la vancomicina.

2. Medio segun la reivindicacion 1, que comprende ademas un agente opacante, el cual es caolin o dioxido de titanio y esta presente a una concentracion de 0, 1 - 5 g/l de medio.

3. Medio segun cualquier reivindicacion precedente que comprende ademas un agente selectivo escogido de uno o mas de los grupos formados por: un compuesto antifungico; aztreonam; eritromicina; poliximina B y sales de la misma;

cefoxitina; anfotericina B.

4. Medio segun cualquier reivindicacion precedente que comprende ademas un segundo substrato cromogeno que lleva un grupo galactopiranosilo -como substrato para un enzima galactopiranosido producido por una segunda especie de enterococo resistente a la vancomicina -de modo que dicho segundo substrato cromogeno produce una segunda seral detectable en presencia de dicha segunda especie de enterococo resistente a la vancomicina.

5. Medio segun cualquier reivindicacion precedente, cuyo primer substrato cromogeno se selecciona de la lista formada por: 5-bromo-3-indolil-fosfato disodico o de p-toluidina (azul) ; 5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato disodico o de p-toluidina (azul verdoso) ; 5-bromo-6-cloro-3-indolil-fosfato disodico o de p-toluidina (magenta) ; 6-cloro-3-indolil-fosfato disodico o de p-toluidina (rosa) ; 3-indolil-fosfato disodico o de p-toluidina (azul) ; y

fluorogenos 6-fluoro-3-indolil-fosfato disodico o de p-toluidina; y 4-metilumbeliferil-fosfato disodico o de p-toluidina.

6. Medio segun la reivindicacion 5, en que el primer substrato cromogeno es 5-bromo-3-indolil-fosfato disodico.

7. Medio segun la reivindicacion 4 o las reivindicaciones 5 y 6, en tanto que dependientes de la reivindicacion 4, en que el segundo substrato cromogeno se selecciona de la lista formada por: 5-bromo-3-indolil-a-galactopiranosido (azul) ; 5-bromo-4-cloro-3-indolil-a-galactopiranosido (azul verdoso) ; 5-bromo-6-cloro-3-indolil-a-galactopiranosido (magenta) ;

6. cloro-3-indolil-a-galactopiranosido (rosa) ; 3-indolil-a-galactopiranosido (azul) ; y

fluorogenos 6-fluoro-3-indolil-a-galactopiranosido; y 4-metilumbeliferil-a-galactopiranosido.

8. Medio segun la reivindicacion 7, en el cual el segundo substrato cromogeno es 6-cloro-3-indolil-a-galactopiranosido.

9. Medio segun cualquier reivindicacion precedente, en que la primera especie enterococica es E. faecalis.

10. Medio segun la reivindicacion 4, las reivindicaciones 5 y 6, en tanto que dependientes de la reivindicacion 4, o las reivindicaciones 7, 8 y 9, en que la segunda especie enterococica es E. faecium.

11. Metodo para detectar E. faecalis y E. faecium y distinguirlos, que consiste en inocular una muestra biologica en un medio segun cualquiera de las reivindicaciones 4, 5 y 6, en tanto que dependientes de la reivindicacion 4, o de

las reivindicaciones 7, 8 y 9, incubarla para lograr el crecimiento de enterococos y examinar en el medio la aparicion de la primera y segunda serales detectables.