NUEVAS SECUENCIAS DE ACIDO NUCLEICO Y SU USO EN METODOS PARA LOGRAR RESISTENCIA EN PLANTAS FRENTE A PATOGENOS.

Método para lograr o incrementar la resistencia frente a al menos un patógeno en vegetales caracterizado porque comprende los siguientes pasos de proceso

a)Reducción de la cantidad de proteína,

actividad o función de una proteína RacBs en un vegetal o un tejido, órgano, parte o célula del mismo y

b)selección de los vegetales en los que, a diferencia o en comparación con la planta de partida, existe o se ha incrementado la resistencia frente a al menos un patógeno

Nuevas secuencias de ácido nucleico y su uso en métodos para lograr resistencia en plantas frente a patógenos.

La invención se refiere a métodos para generar o elevar una resistencia frente a patógenos en plantas mediante la reducción de la expresión de una proteína RacB o un de un equivalente funcional de la misma, así como a los organismos, células, cultivos celulares, tejidos, plantas y material de reproducción de los mismos obtenidos con este método.

Un objeto de los trabajos biotecnológicos en plantas es la producción de plantas con propiedades novedosas ventajosas, por ejemplo para elevar la productividad agrícola, para aumentar la calidad en los productos alimenticios o para la producción de determinados productos químicos o farmacéuticos (Dunwell JM (2000) J Exp Bot 51 Spec No:487-96). Con frecuencia los mecanismos naturales de defensa de las plantas frente a los patógenos no son suficientes. Solo las enfermedades por hongos conducen a pérdidas de cosecha por un valor de varios millardos de dólares de Estados Unidos de América al año. La introducción de genes ajenos de las plantas, animales o de fuentes microbianas puede reforzar la defensa. Ejemplos son la protección frente al resultado de la alimentación de insectos en el tabaco mediante expresión de endotoxinas de Bacillus thuringiensis bajo control del promotor 35 S CaMV (Vaeck et al. (1987) Nature 328:33-37) o la protección del tabaco frente a la infestación de hongos mediante expresión de una quitinasa a partir del grano bajo control del promotor CaMV (Broglie et al. (1991) Science 254:1194-1197). Sin embargo, la mayoría de los planteamientos escritos sólo ofrecen una resistencia frente a un patógeno individual o frente a un espectro estrecho de patógenos.

Existen solo pocos planteamientos que confieren a las plantas una resistencia frente a un espectro amplio de patógenos, ante todo patógenos fúngicos. La resistencia sistémica adquirida ("systemic acquired resistance"; SAR) - un mecanismo de defensa en casode diferentes interacciones planta/patógeno - puede procurarse por aplicación de sustancias mensajeras endógenas, tales como jasmonates (JA) o ácido salicílico (SA) (Ward, et al. (1991) Plant Cell 3:1085-1094; Uknes, et al. (1992) Plant Cell 4(6):645-656). También pueden lograrse efectos similares mediante composiciones sintéticas como ácido 2,6-dicloroisonicotínico (INA) o S-metilo benzo(1,2,3)tiadiazol-7-tiocarboxilato (BTH; Bion®) (Friedrich y colaboradores (1996) Plant J 10(1):61-70; Lawton y colaboradores (1996) Plant J. 10:71-82). La expresión de una proteína "pathogenesis related" (PR) (relacionada con patogénesis) que es altamente regulada en el contexto de una SAR, también puede causar parcialmente resistencia patógena.

Desde hace tiempo ya se ha descrito el Mlo-locus en cebada como regulador negativo de la defensa frente a patógenos. La pérdida o pérdida de función ("loss-of-function") del gen Mlo condiciona una resistencia elevada, y ante todo no específica para la raza, por ejemplo frente a numerosos tipos de mildiú (Büschges R y colaboradores (1997) Cell 88:695-705; Jorgensen JH (1977) Euphytica 26:55-62; Lyngkjaer MF y colaboradores (1995) Plant Pathol 44:786-790). El fenotipo Mlo se hereda de manera recesiva lo cual también sugiere una función como gen de susceptibilidad. Las variedades de cebada deficientes de Mlo obtenidas mediante cultivo clásico se usan ya ampliamente en la agricultura. Aunque estas variedades ya se han cultivado intensivamente, la resistencia ha demostrado ser extraordinariamente durable, supuestamente debido a la recesividad. Hasta ahora no se han presentado rupturas en la resistencia. Resistencias similares a Mlo en otras plantas, especialmente en especies cereales, no se han descrito a pesar de que el trigo, el centeno y otros cereales también se infestan por patógenos comparables con mildiú. La razón en el caso del trigo puede ser, por ejemplo, la presencia de un genoma hexaploide, lo cual dificulta en extremo la identificación de mutantes en los que cada una de las seis copias del gen ha sido desactivada.

El gen Mlo solo se ha clonado recientemente (Büschges R y colaboradores (1997) Cell 88:695-705; WO 98/04586; Schulze-Lefert P, Vogel J (2000) Trends Plant Sci. 5:343-348). Como consecuencia se han aislado diversos homólogos de otras variedades de cereales. Se han descrito diversos métodos en los que se usan estos genes para lograr una resistencia a patógenos. (WO 98/04586; WO 00/01722; WO 99/47552).

La resistencia condicionada por Mlo de una planta frente a un mildiú patógeno se manifiesta en dos eventos esenciales que causan ambos una resistencia a la penetración: una formación de papilas ("cell wall apposition"; CWA) debajo del sitio de penetración del patógeno en la pared celular de la epidermis. La propagación del patógeno fúngico se restringe casi exclusivamente a esta estructura subcelular. (Jorgensen JH y Mortensen K (1977) Phytopathology 67:678-685; Freialdenhoven A y colaboradores (1996) Plant Cell 8:5-14). Esta reacción es causada por los genes Ror1 y Ror2 que se requieren para la acción de Mlo (Peterhänsel C y colaboradores (1997) 9:1397-1409). La desventaja a la resistencia a patógeno de Mlo es que las plantas con deficiencia de Mlo - incluso en ausencia de un patógeno - inician un mecanismo de defensa que se manifiesta en la muerta espontanea de las células de la hoja, por ejemplo. (Wolter M y colaboradores (1993). Mol Gen Genet 239: 122-128). Otra desventaja es que los genotipos con deficiencia de Mlo son hipersusceptibles a patógenos hemibiotróficos, tales como Magnaporte grisea (M. grisea) así como Cochliobolus sativus (Bipolaris sorokiniana) (Jarosch B y colaboradores (1999) Mol Plant Microbe Interact 12:508-514; Kumar J y colaboradores (2001) Phytopathology 91:127-133). Por lo tanto, el gen de Mlo parece ser un regulador negativo de la muerte celular. Así mismo, la causa es supuestamente la inducción de muerte celular en ausencia del gen Mlo, lo cual aumenta la susceptibilidad frente a este patógeno bastante necrotrófico. Este efecto ambivalente que limita la aplicación biotecnológica de Mlo se debe probablemente al hecho de que los hongos necrotróficos son capaces de aprovechar los HR más fuertes de la planta con deficiencia de Mlo para su proceso de infección. Sería deseable que una deficiencia de Mlo fuera comparable a una resistencia pero sin la característica de inducir muerte celular.

Las proteínas Rho, Rac y Cdc42 son miembros de la familia de las pequeñas proteínas de enlace de GTP (guanosintrifosfato) y regulan numerosos procesos intracelulares como "interruptores moleculares", tanto en organismos vegetales como también en organismos animales. Como unidad estructural de la transducción de señal tienen un papel importante en la conversión de estímulos extracelular. Regulan, por ejemplo, la NADPH oxidasa y con esto la liberación de moléculas reactivas de oxígeno ("oxidative burst"). La Rac1 animal o humana es esencial para la formación del complejo de oxidasa activo NADPH que a su vez es importante para la formación de superóxido y de esta manera proporciona un aporte a la defensa frente a patógenos (Irani K y Goldschmidt-Clermont PJ (1998) Biochem Farmacol 55: 1339-1346). La función en la defensa de patógenos es en gran medida análoga en plantas y en animales. (Kwong y colaboradores (1995) J Biol Chem 270(34): 19868- 19872; Dusi y colaboradores (1996) Biochem J 314:409-412; Diekmann y colaboradores (1994) Science 265:531-533; Purgin y colaboradores (1997) The Plant Cell 9:2077-2091; Kleinberg y colaboradores (1994) Biochemistry 33:2490-2495; Prigmore y colaboradores (1995) Journal of Biol Chem 27(18): 10717-10722; Irani y colaboradores (1997) Science 275:1649-1652; Low y colaboradores (1994) Advances in Molecular Genetics of Plant-Microbe Interactions 3:361-369 (1994) eds. MJ Daniels, Kluwer Acadmic Publishers, Netherlands; Mehdy y colaboradores (1994) Plant Physiol 105: 467-472; Sundaresan y colaboradores (1996) Biochem J 318:379-382). Además, las proteínas de enlace de GTP tienen una función en la reestructuración del citoesqueleto y de la transformación celular (Symon M. (1996) TIBS 21: 178-181), así como en el caso de la activación de la transcripción (Hill y colaboradores (1995) Cell 81:1159-1170; Chandra y colaboradores (1996) Proc Natl Acad Sci USA 93:13393-13397).

En los vegetales existe una familia más grande de proteínas similares a Rac (Winge y colaboradores (1997) Plant Mol Biol 35: 483-495), que también se denominan familia Rop (Lin y colaboradores (1997) The Plant Cell 9:1647-1659). En vegetales las proteínas Rac parecen tener una función en...

1. Método para lograr o incrementar la resistencia frente a al menos un patógeno en vegetales caracterizado porque comprende los siguientes pasos de proceso

2. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque la proteína RacB se selecciona del grupo de las proteínas compuesto de

3. Método según la reivindicación 2, caracterizado porque el equivalente funcional tiene una homología de al menos 64% con uno de los polipéptidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 2, 4 o 6.

4. Método según la reivindicación 2 ó 3, en el cual el equivalente funcional tiene una homología de al menos 90% con uno de los polipéptidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 2, 4 ó 6.

5. Método según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la reducción de la proteína RacBs se asegura mediante la aplicación de un método seleccionado del grupo compuesto de

6. Método según una de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende

7. Método según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque el patógeno se selecciona del grupo que se compone de bacterias, hongos, insectos, viruses y nematodos.

8. Método según una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque el patógeno se selecciona del grupo de los hongos que se compone de Plasmodioforamycota, Oomycota, Ascomycota, Chitridiomyceten, Zygomycetes, Basidiomycota y Deuteromycetes.

9. Método según una de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque el vegetal se selecciona de las plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas.

10. Método según una de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque el vegetal se selecciona del grupo que se compone de trigo, avena, mijo, cebada, centeno, maíz, arroz, alforfón, sorgo, triticale, espelta, linaza o caña de azúcar.

11. Método según una de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque la proteína RacB de cebada es una según SEQ ID NO: 2.

12. Método según una de las reivindicaciones 4 a 10, caracterizado porque la variante dominante negativa según la reivindicación 6 se describe por la SEQ ID NO: 7.

13. Organismo vegetal transgénico o una célula, cultivo celular, un tejido, una parte o material de propagación de éste, obtenido según un método según las reivindicaciones 1 a 12.

14. Organismo vegetal transgénico según la reivindicación 13 en el que el vegetal se selecciona del grupo de los vegetales que se compone de trigo, avena, mijo, cebada, centeno, maíz, arroz, alforfón, sorgo, triticale, espelta, linaza, caña de azúcar, colza, canola, berro, arabidopsis, variedades de col, soya, alfalfa, arvejas, frijol, maní, patata, tabaco, tomate, berenjenas, pimentón, girasol, tagetes, lechuga, caléndula, melón, calabaza y calabacín.