NUEVAS PROTEINAS TRANSPORTADORAS DE ANIONES ORGANICOS.
Una secuencia de ácido nucleico que codifica toda o una parte de la proteína transportadora de aniones orgánicos OATP2,
seleccionándose dicha secuencia de ácido nucleico del grupo constituido por:
(a) una secuencia de ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico mostrada en la SEC ID Nº: 1;
(b) una secuencia de ácido nucleico que codifica toda o una parte de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº: 2, en la que la parte transporta pravastatina en los hepatocitos;
(c) una secuencia de ácido nucleico que comprende la región codificante de (a);
(d) una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de ácido nucleico de una cualquiera de (a) a (c) que difiere debido a la degeneración del código genético;
(e) una secuencia de ácido nucleico que comprende la secuencia que codifica la OATP2 depositada en la Colección Americana de Cultivos Tipo con el Número de Acceso 207213; o
(f) una secuencia de nucleótidos que comprende la complementaria de la secuencia de nucleótidos de una cualquiera de (a), (c), o (e)
Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US00/13939.
Solicitante: BRISTOL-MYERS SQUIBB COMPANY.
Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.
Dirección: P.O. BOX 4000,PRINCETON, NJ 08543-4000.
Inventor/es: YANG,WEN-PIN, KIRCHGESSNER,TODD,G, HSIANG,BONNIE, ZHU,YINGJIE, WU,YULI, WANG,ZHAOQING, LYNCH,JEAN,S, HUANG,XIN.
Fecha de Publicación: .
Fecha Concesión Europea: 19 de Mayo de 2010.
Clasificación Internacional de Patentes:
- C07K14/47 QUIMICA; METALURGIA. › C07 QUIMICA ORGANICA. › C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02; proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 14/00 Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados. › de mamíferos.
Clasificación PCT:
- A61K38/16 NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA. › A61 CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE. › A61K PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO (dispositivos o métodos especialmente concebidos para conferir a los productos farmacéuticos una forma física o de administración particular A61J 3/00; aspectos químicos o utilización de substancias químicas para, la desodorización del aire, la desinfección o la esterilización, vendas, apósitos, almohadillas absorbentes o de los artículos para su realización A61L; composiciones a base de jabón C11D). › A61K 38/00 Preparaciones medicinales que contienen péptidos (péptidos que contienen ciclos beta-lactama A61K 31/00; dipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina 2,5-dionas, A61K 31/00; péptidos basados en la ergolina A61K 31/48; que contienen compuestos macromoleculares que tienen unidades aminoácido repartidas estadísticamente A61K 31/74; preparaciones medicinales que contienen antígenos o anticuerpos A61K 39/00; preparaciones medicinales caracterizadas por los ingredientes no activos, p. ej. péptidos como soportes de fármacos, A61K 47/00). › Péptidos que tienen más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados.
- A61K38/17 A61K 38/00 […] › que provienen de animales; que provienen de humanos.
- C07K14/435 C07K 14/00 […] › de animales; de humanos.
- C07K16/18 C07K […] › C07K 16/00 Inmunoglobulinas, p. ej. anticuerpos mono o policlonales. › contra materiales animales o humanos.
- C12N15/12 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Genes que codifican proteínas animales.
- C12N5/10 C12N […] › C12N 5/00 Células no diferenciadas humanas, animales o vegetales, p. ej. líneas celulares; Tejidos; Su cultivo o conservación; Medios de cultivo para este fin (reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00). › Células modificadas por introducción de material genético extraño, p. ej. células transformadas por virus.
- G01N33/53 FISICA. › G01 METROLOGIA; ENSAYOS. › G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 33/00 Investigación o análisis de materiales por métodos específicos no cubiertos por los grupos G01N 1/00 - G01N 31/00. › Ensayos inmunológicos; Ensayos en los que interviene la formación de uniones bioespecíficas; Materiales a este efecto.
- G01N33/567 G01N 33/00 […] › utilizando un extracto de tejido o de órgano como agente de unión.
Clasificación antigua:
- C07K C07 […] › PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02; proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00).
Fragmento de la descripción:
Nuevas proteínas transportadoras de aniones orgánicos.
Campo de la invención
La invención reivindica un ácido nucleico aislado que codifica toda o una parte del nuevo miembro de las proteínas transportadoras de aniones orgánicos ("OATP") denominado OATP2.
También reivindica vectores que contienen las secuencias de ácido nucleico, células huésped que contienen los vectores y polipéptidos que tienen toda o parte de la secuencia de aminoácidos de OATP2.
Se describe la expresión del transportador en el tejido así como algunos de sus sustratos. También se reivindican los usos de esta nueva OATP, incluyendo la dirección de fármacos a tejidos específicos, para modular la concentración de sustratos endógenos y para identificar un sustrato que pueda transportarse por la nueva OATP de la invención.
Antecedentes de la invención
El hígado funciona en el aclaramiento de una gran variedad de productos metabólicos, fármacos y otros compuestos xenobióticos trasportándolos a través de la membrana sinusoidal hacia el interior del hepatocito. Se han descrito diversas clases de sistemas de transporte que median estos procesos incluyendo el polipéptido cotransportador de Na+/taurocolato, NTCP, en el hígado de rata y de ser humano (Hagenbuch, B., y col. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10629-33; Hagenbuch, B., y col. (1994) J. Clin. Invest 93:1326-31) y una familia de polipéptidos transportadores de aniones orgánicos (OATP) que se expresan principalmente en el hígado, riñón y cerebro y transportan un amplio espectro de sustratos de una manera independiente del sodio (Meier, P. J., y col., (1997) Hepatology 26:1667-77; Wolkoff, A.W., (1996) Semin. Liver Dis. 16:121-127). La distribución de esta última familia de transportadores en el hígado, riñón y plexo coroideo en el cerebro se cree que refleja las necesidades fisiológicas comunes de estos órganos para el aclaramiento de una multitud de aniones orgánicos. En la rata existen tres isoformas de OATP: roatp1 (Jacquemin, E., y col., (1994) Proc, Natl. Acad. Sci. USA 91:133-37); roatp2 (Noe, B.A., y col., (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:10346-50; y roatp3 (Abe, T., y col., (1998) J. Biol. Chem. 273:11395-401). Además de los ácidos biliares, se sabe que las OATP transportan una diversidad de otros compuestos. Éstos incluyen, dependiendo del transportador, esteroides no conjugados y conjugados tales como sulfato de estrona, estradiol-17B-glucuronida, aldosterona y glucósidos cardiacos (Boussuyt, X., y col., (1996) J. Pharmacol. Exp. Ther. 276: 891-6; Boussuyt, X. (1996) J. Hepatol. 25:733-8; Kanai, N., y col., (1996) Am. J. Physiol. 270: F319-F325; Kanai, N., y col., (1996) Am. J. Physiol. 270: F326-F331; Noe, B.A., y col., (1997) Proc. Natl. Acad Sci. USA 94: 10346- 50). La bromosulfoftaleína (Jacquemin, E. y col-. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:133-7); la micotoxina (Kontaxi, M., y col., (1996) J. Pharmacol. Exp. Ther- 279:1507-13); el leucotrieno C4 (Li, L., y col., (1998) J. Biol. Chem. 273:16184-91); y la hormona tiroidea (Abe, T., y col., (1998) J. Biol. Chem. 273:11395) son sustratos adicionales.
Se han identificado diversas proteínas. Jacquemin, E., y col (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 91:133-137 describieron la primera clonación e identificación de un miembro de la familia de transportadores OATP, concretamente la oatp1 de rata. La primera clonación e identificación de una OATP en seres humanos se describió en Kullac-Ublick, G. A., y col., (1995) Gastroenterology, 109:1274-1282. Su expresión se encontró en hígado, riñón, cerebro y otros órganos. Basándose en las especificidades de sustrato, los autores llegaron a la conclusión de que no era el ortólogo humano de la oatp1 de rata.
Las especificidades de sustrato de la oatp1 de rata se comentan en Kullak-Ublick, G. A. y col., (1994) Hepatology, 20:411-416, mientras que las especificidades de sustrato de la OATP humana se comentan en Bossuyt, X., y col., (1996) J. Hepatol., 25:733-738.
Posteriormente se descubrieron datos demostrando que la oatp1 de rata está implicada en el transporte de esteroides (Bossuyt, X. y col., (1996) J. Pharmacol. Exp. Ther-. 276:891-896), y la OATP humana actúa como un transportador para la horma psicoactiva DHEAS (Kullak-Ublick, G.A., y col., (1998) FEBS Lett., 424:173-176). Para una revisión de la familia OATP y el transporte de aniones orgánicos en el hígado, véase Wolkoff, A. W., (1996) Semin. LiverDis., 16:121-127.
Una tercera isoforma de OATP de rata que se demostró que transportaba las hormonas tiroideas T3 y T4 se clonó y se describió en Abe, T., y col., (1998) J. Biol. Chem., 273:22395-22401.
Sumario de la invención
La presente invención incluye una nueva proteína transportadora de aniones orgánicos ("OATP") y polinucleótidos que codifican dicha OATP. La OATP desvelada en el presente documento se denomina OATP2. En el presente documento se desvela una secuencia polinucleotídica de la OATP, junto con la secuencia de aminoácidos deducida. El ADNc que codifica la OATP de la presente invención se ha depositado en la Colección Americana de Cultivos Tipo y se le ha asignado el Número de Acceso ATCC 207213 (OATP2).
Los presentes inventores han secuenciado el ADNc que codifica la nueva OATP y han determinado la secuencia primaria de la proteína deducida. En el presente documento se desvela la secuencia de ácido nucleico (SEC ID Nº: 1) y la secuencia de aminoácidos (SEC ID Nº: 2) de la OATP2.
La OATP de la presente invención puede producirse: (1) insertando el ADNc de una OATP desvelada en un vector de expresión apropiado; (2) transfectando el vector de expresión en un huésped (o huéspedes) de transfección apropiado; (3) cultivando el huésped (o huéspedes) transfectado en un medio de cultivo apropiado; y (4) ensayando la actividad de transporte en las células transfectadas.
La presente invención por lo tanto proporciona una molécula de ácido nucleico purificada y aislada, preferentemente una molécula de ADN, que tiene una secuencia que codifica una OATP, o un fragmento oligonucleotídico de la molécula de ácido nucleico que es único para una OATP de la presente invención. La molécula de ácido nucleico purificada y aislada tiene la secuencia como se muestra en la SEC ID Nº: 1 (OATP2).
La presente invención también contempla una molécula de ácido nucleico bicatenario que comprende una molécula de ácido nucleico de la invención o un fragmento oligonucleotídico de la misma unida por enlace de hidrógeno a una secuencia de bases de nucleótidos complementaria.
Las expresiones "ácido nucleico aislado y purificado", "polinucleótido aislado y purificado", "ácido nucleico sustancialmente puro" y "polinucleótido sustancialmente puro", por ejemplo, ADN sustancialmente puro, se refieren a una molécula de ácido nucleico que es una o ambas de las siguientes: (1) no inmediatamente contigua a una o a las dos secuencias, por ejemplo, secuencias codificantes, con la que es inmediatamente contigua (es decir, una en el extremo 5' y otra en el extremo 3') en el genoma de origen natural del organismo a partir del cual procede el ácido nucleico; o (2) que carece sustancialmente de una secuencia de ácido nucleico con la que aparece en el organismo a partir del cual procede el ácido nucleico. El término incluye, por ejemplo, un ADN recombinante que se incorpora en un vector, por ejemplo, en un plásmido o virus de replicación autónoma o en el ADN genómico de un procariota o eucariota o que existe como una molécula distinta (por ejemplo, un ADNc o un fragmento de ADN genómico producido por PCR o por tratamiento con endonucleasas de restricción) independiente de otras secuencias de ADN. El ADN sustancialmente puro o aislado y purificado también incluye un ADN recombinante que es parte de un gen híbrido que codifica una secuencia adicional de OATP.
También se describe (a) una molécula de ácido nucleico aislada y purificada que comprende una secuencia que codifica toda o una parte de una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEC ID Nº: 2 (OATP2); (b) secuencias de ácido nucleico complementarias a (a); (c) secuencias de ácido nucleico que presentan una identidad de secuencia de al menos el 80%, al menos el 90%, al menos el 95% y al menos el 98% con (a); o (d) un fragmento de (a) o (b) que tiene al menos 18 bases y que hibridará con (a) o (b) en condiciones rigurosas.
El grado de homología (porcentaje de identidad de secuencia) entre dos secuencias puede determinarse, por ejemplo, comparando las dos secuencias usando programas informáticos...
Reivindicaciones:
1. Una secuencia de ácido nucleico que codifica toda o una parte de la proteína transportadora de aniones orgánicos OATP2, seleccionándose dicha secuencia de ácido nucleico del grupo constituido por:
2. Un vector de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 1 y una secuencia de control de expresión unida operativamente a la molécula de ácido nucleico.
3. Una célula huésped que incluye, de una manera expresable, la secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 1 o el vector de la reivindicación 2.
4. Un procedimiento para producir OATP2, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:
5. Una OATP2 codificada por la secuencia de nucleótidos de la reivindicación 1 u obtenible por el procedimiento de la reivindicación 4.
6. Un anticuerpo específico para la OATP2 de la reivindicación 5.
7. El anticuerpo de la reivindicación 7, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
8. Una proteína de fusión que comprende la OATP2 de la reivindicación 5, unida a un segundo polipéptido.
9. Un procedimiento para identificar un ligando que puede unirse a la OATP2 de la reivindicación 5, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:
10. Un procedimiento para identificar un substrato que puede transportarse por la OATP2 de la reivindicación 5, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:
11. Un procedimiento para identificar un modulador que puede aumentar o inhibir el transporte de un sustrato por la OATP2 de la reivindicación 5, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:
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