Método para la producción microbiológica de alcanoles sustituidos de la fórmula I

Nuevas deshidrogenasas, y un método para la producción de alcanoles ópticamente activos.

La presente invención se refiere a proteínas que exhiben actividad enzimática para la reducción de alcanonas. La invención se refiere además a ácidos nucleicos, que codifican para estas proteínas, fragmentos de ácido nucleico, vectores, microorganismos genéticamente modificados así como métodos para la producción de alcanoles substituidos ópticamente activos, en particular alcanoles (S) como por ejemplo (S)-3-metilamino1-(2-tienil)-(S)-propanol.

Estado de la técnica

Las deshidrogenasas son catalizadores utilizables para muchos usos para la reducción enantioselectiva de aldehído o cetonas hasta los correspondientes alcoholes. En ello se diferencian deshidrogenasas (R)- y (S)-específicas. Estos catalizadores son empleados en medida creciente para la síntesis industrial del alcoholes ópticamente activos. La actividad óptica es la condición para el efecto selectivo de muchos principios activos farmacéuticos y agrícolas. Aquí un enantiómero puede tener el efecto deseado y el otro enantiómero tener un efecto genotóxico. Por esta razón, en la síntesis de principios activos farmacéuticos y agrícola se emplean catalizadores para la producción de alcoholes ópticamente activos que poseen la estereoespecificidad requerida.

En la literatura (ver EP-A-0 273 658) se describen rutas de síntesis hasta duloxetinealcohol y duloxetina. Es desventaja de esta ruta de síntesis que ella conduce hasta mezcla racémica de alcoholes y a continuación es necesaria una separación del racemato mediante transformación del racemato en una mezcla de diastereoisómeros mediante formación de sales con un ion contrario ópticamente activo. A continuación ocurre una separación física del diastereoisómero. Por consiguiente resultan altos costos en el método debido a las repetidas separaciones sólido-líquido y al elevado gasto de insumos mediante adición de una sal ópticamente activa para la separación.

La reducción estereoespecífica de 3-metilamino-1-(2-tienil)-propanona había ofrecido un acceso favorable en costo hasta duloxetinalcohol.

EP1152054 describe nuevas carbonilreductasas y su aplicación para la producción de tert. butil (3R, 5S)- 6-cloro-3,5 dihidroxihexanoato.

WO04/90094 describe carnitin-deshidrogenasas y su aplicación para la producción de alcanoles ópticamente activos.

Corta descripción de la invención

La invención basó su objetivo en encontrar un camino para la reducción estereoespecífica de alcanonas sustituidas.

Este objetivo fue logrado poniendo a disposición nuevas deshidrogenasas, que son capaces de catalizar de modo estereoespecífico la reacción descrita arriba.

Un primer objetivo de la invención se refiere a un método para la producción microbiológica, en particular enantioselectiva de alcanoles sustituidos de la fórmula I

donde

donde en un medio que contiene una alcanona de la fórmula II

donde n, Cyc y R¹ poseen los significados arriba indicados,

Preferiblemente en este método se emplea una enzima con una secuencia de polipéptido de acuerdo con SEQ ID NO:2 o NO:4.

Tales enzimas pueden ser aisladas por ejemplo de microorganismos del género Candida.

En una forma particularmente preferida de operar del método, se elige la enzima de entre enzimas que abarcan una secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 2, 4, o que codifican secuencias de ácidos nucleicos derivados de ella; y en la que hasta 25% de los radicales aminoácido son cambiados mediante deleción, inserción, sustitución o una combinación de ellos, la cual posee actividad de deshidrogenasa y cataliza la síntesis enantioselectiva de un compuesto de la fórmula I.

Por ejemplo, la enzima con actividad de deshidrogenasa puede ser modificada de una secuencia de ácido nucleico según SEQ ID NO:9 o NO:3 o de enzimas en las cuales el 25% de los radicales aminoácido mediante deleción; inserción, sustitución o una combinación de ellos.

Preferiblemente el método acorde con la invención se ejecuta mediante la suplementación de equivalentes de reducción (NADH o NADPH) o en las condiciones (bioquímicas o electroquímicas) que regeneran equivalentes de reducción consumidos en la reacción.

Además se prefiere dejar que ocurra la reacción del compuesto de la fórmula general II en presencia de microorganismos que son elegidos de entre bacterias de las familias Enterobacteriaceae, Pseudomonadaceae, Rhizobiaceae, Streptomycetaceae y Nocardiaceae. El microorganismo puede en particular ser un microorganismo recombinante, el cual está transformado con un fragmento de ácido nucleico, el cual codifica para una enzima acorde con la invención con actividad de deshidrogenasa según la definición dada arriba.

Es objetivo de la invención en particular un método según la definición dada arriba, donde

La invención se refiere además a un método para la producción de un compuesto de la fórmula general III

donde n, Cyc, y R¹ tienen los significados arriba indicados y Ar representa un radical arilo mono o polinuclear, dado el caso sustituido, y donde

(IV)Ar-Y

donde Ar posee los significados indicados arriba y Y representa un grupo saliente, y

1. Método para la producción microbiológica de alcanoles sustituidos de la fórmula I

donde

donde n, Cyc y R¹ poseen los significados arriba indicados,

donde el compuesto de la fórmula II es reducido enzimáticamente hasta el compuesto de la fórmula I, y se aísla el producto formado.

2. Método según una de las reivindicaciones precedentes, donde la enzima con actividad de deshidrogenasa se elige entre enzimas que incluyen una secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 2 o 4, en la que hasta 25% de los radicales aminoácido son cambiados mediante deleción, inserción, sustitución o una combinación de ellos, la cual posee actividad de deshidrogenasa y cataliza la síntesis enantioselectiva de un compuesto de la fórmula I.

3. Método según una de las reivindicaciones precedentes donde la enzima con actividad de deshidrogenasa es codificada por una secuencia de nucleico según SEQ ID NO:1 o 3, en la cual hasta 25% de los radicales aminoácidos es modificado por borrado; inserción, sustitución o una combinación de ellos.

4. Método según una de las reivindicaciones precedentes, donde la reacción se realiza por adición de equivalentes de reducción o bajo las condiciones regenerantes de los equivalentes de reducción requeridos por la reacción.

5. Método según una de las reivindicaciones precedentes, donde la reacción del compuesto de la formula II se realiza en presencia de un microorganismo que es elegido de entre bacterias de las familias Enterobacteriaceae, Pseudomonadaceae, Rhizobiaceae, Streptomycetaceae y Nocardiaceae.

6. Método según una de las reivindicaciones precedentes, donde el microorganismo es un microorganismo recombinate, el cual es transformado con un fragmento de ácido nucleico, el cual codifica para una enzima con actividad de deshidrogenasa según la definición de una de las reivindicaciones 2 a 5.

7. Polipéptido que incluye una secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 2 o 4, en el que hasta 25% de los radicales aminoácido ha sido modificado por borrado; inserción, sustitución o una combinación de ellos y la cual posee actividad de deshidrogenasa y cataliza la síntesis enantioselectiva de un compuesto de la formula I.

8. Secuencia de ácidos nucleicos, que incluye la secuencia codificante para un polipéptido según la reivindicación 7.

9. Casete de expresión, que incluye una secuencia de ácido nucleico según la reivindicación 8, en enlace operativo con por lo menos una secuencia reguladora de ácido nucleico.

10. Vector recombinante, que incluye por lo menos una casete de expresión según la reivindicación 9.

11. Anfitrión procariótico o eucariótico, transformado con por lo menos un vector según la reivindicación 10.

12. Empleo de una enzima con actividad de deshidrogenasa según la reivindicación 7 para la producción de compuestos de la formula I.