NUEVA GLUCOSA-6-FOSFATO DESHIDROGENASA.
ADN que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de entre el grupo constituido por:
(a) una secuencia de nucleótidos representada por la SEC ID nº:11;
(b) una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos representa por la SEC ID nº:12 o
(c) una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que presenta una homología del 95% o superior con la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID nº:2, y que presenta actividad de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, en el que está presente una treonina en la posición 213
Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/JP01/05113.
Solicitante: KYOWA HAKKO KOGYO CO., LTD..
Nacionalidad solicitante: Japón.
Dirección: 6-1, OHTEMACHI 1-CHOME,CHIYODA-KU, TOKYO 100-8185.
Inventor/es: YOKOI,H, ANDO,S, OCHIAI,K, YONETANI,Y, HASHIMOTO,S.
Fecha de Publicación: .
Fecha Concesión Europea: 24 de Marzo de 2010.
Clasificación Internacional de Patentes:
- C12N9/04 QUIMICA; METALURGIA. › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 9/00 Enzimas, p. ej. ligasas (6.); Proenzimas; Composiciones que las contienen (preparaciones para la limpieza de los dientes que contienen enzimas A61K 8/66, A61Q 11/00; preparaciones de uso médico que contienen enzimas A61K 38/43; composiciones detergentes que contienen enzimas C11D ); Procesos para preparar, activar, inhibir, separar o purificar enzimas. › actúan sobre grupos CHOH como dadores, p. ej. glucosa oxidasa de glucosa, deshidrogenasa láctica (1.1).
- C12P13/04 C12 […] › C12P PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN ENZIMAS PARA LA SINTESIS DE UN COMPUESTO QUIMICO DADO O DE UNA COMPOSICION DADA, O PARA LA SEPARACION DE ISOMEROS OPTICOS A PARTIR DE UNA MEZCLA RACEMICA. › C12P 13/00 Preparación de compuestos orgánicos que contienen nitrógeno. › alfa- o beta-Aminoácidos.
- C12P13/08 C12P 13/00 […] › Lisina; Acido diaminopimélico; Treonina; Valina.
Clasificación PCT:
- C12N15/53 C12N […] › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Oxidorreductasas (1).
- C12N9/04 C12N 9/00 […] › actúan sobre grupos CHOH como dadores, p. ej. glucosa oxidasa de glucosa, deshidrogenasa láctica (1.1).
- C12P13/04 C12P 13/00 […] › alfa- o beta-Aminoácidos.
Clasificación antigua:
- C12N1/21 C12N […] › C12N 1/00 Microorganismos, p.ej. protozoos; Composiciones que los contienen (preparaciones de uso médico que contienen material de protozoos, bacterias o virus A61K 35/66, de algas A61K 36/02, de hongos A61K 36/06; preparación de composiciones de uso médico que contienen antígenos o anticuerpos bacterianos, p. ej. vacunas bacterianas, A61K 39/00 ); Procesos de cultivo o conservación de microorganismos, o de composiciones que los contienen; Procesos de preparación o aislamiento de una composición que contiene un microorganismo; Sus medios de cultivo. › modificados por la introducción de material genético extraño.
- C12N15/53 C12N 15/00 […] › Oxidorreductasas (1).
- C12N15/63 C12N 15/00 […] › Introducción de material genético extraño utilizando vectores; Vectores; Utilización de huéspedes para ello; Regulación de la expresión.
- C12N9/04 C12N 9/00 […] › actúan sobre grupos CHOH como dadores, p. ej. glucosa oxidasa de glucosa, deshidrogenasa láctica (1.1).
- C12P13/04 C12P 13/00 […] › alfa- o beta-Aminoácidos.
Fragmento de la descripción:
Nueva glucosa-6-fosfato deshidrogenasa.
Campo técnico
La presente invención se refiere a una nueva glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (en adelante denominada "G6PD") obtenida a partir de una bacteria perteneciente al género Corynebacterium, un ADN que codifica dicha enzima, un ADN recombinante que comprende el ADN, un transformante que comprende el ADN recombinante, un transformante que comprende el ADN en su cromosoma y un procedimiento para producir un L-aminoácido que comprende el cultivo del transformante descrito en las reivindicaciones.
Antecedentes de la técnica
Para obtener una cepa bacteriana que produzca un aminoácido con eficacia, es importante conocer las propiedades de los genes relacionados con la biosíntesis del aminoácido en las bacterias y su forma de controlar la expresión y la actividad, y llevar a cabo un cultivo racional basándose en estas características.
Uno de los procedimientos más importantes para comprender las funciones de los genes relacionadas con la producción de aminoácidos es, por ejemplo, un procedimiento genético en el que se dilucida la relación entre el incremento o el decremento de la productividad de aminoácidos y la mutación génica.
El cultivo de microorganismos productores de aminoácidos se realiza principalmente confiriendo resistencia a fármacos tales como los análogos de aminoácidos y otros, pero en muchos casos, no está claro qué gen contribuye a incrementar la productividad a través de su mutación.
Se necesita NADPH como coenzima en la reacción de reducción de la biosíntesis de aminoácidos de muchos microorganismos. Por ejemplo, se necesitan 4 moléculas de NADPH para la biosíntesis de 1 molécula de L-lisina. De la misma manera, se necesitan 3 moléculas de NADPH para 1 molécula de treonina y 5 moléculas de NADPH para 1 molécula de isoleucina. Por lo tanto, se necesitan dos o más moléculas de NADPH para la biosíntesis de 1 molécula de la mayoría de aminoácidos. En consecuencia, el suministro de NADPH es una cuestión importante en la producción de estos aminoácidos utilizando microorganismos.
En muchos microorganismos, las enzimas que suministran NADPH son limitadas. Se considera que las enzimas que pueden suministrar NADPH en las vías principales del metabolismo de los azúcares de los microorganismos son principalmente la G6PD [EC 1.1.1.49] y la 6-fosfogluconato deshidrogenasa [EC 1.1.1.4] en la vía de la pentosa fostato (HMP), y la isocitrato deshidrogenasa [EC 1.1.1.41] en la vía del TCA.
Particularmente, la G6PD, que es la primera enzima de la HMP y también la enzima del punto de división de la vía de Embden-Meyerhof (EMP), es considerada una enzima muy importante para la producción de diversos aminoácidos por bacterias pertenecientes al género Escherichia y el género Corynebacterium, y se han llevado a cabo varios análisis sobre sus diversas propiedades bioquímicas. Por ejemplo, la G6PD de bacterias pertenecientes al género Corynebacterium se describe en el documento Journal of Bacteriology, 98, 1151 (1969), Agricultural and Biological Chemistry, 51, 101 (1987) y en la solicitud de patente japonesa publicada sin examinar n.º 224661/97, pero no se ha dado a conocer ninguna investigación sobre mejora de la productividad de aminoácidos mediante la enzima.
Asimismo, se ha determinado la secuencia de nucleótidos de la G6PD de bacterias tales como Escherichia coli y Corynebacterium glutamicum (Journal of Bacteriology, 173, 968 (1991) y solicitud de patente japonesa publicada sin examinar n.º 224661/97), pero no se ha dado a conocer ninguna investigación sobre mejora de la productividad de aminoácidos mediante el gen.
Exposición de la invención
Un objetivo de la presente invención consiste en producir L-aminoácidos a nivel industrial de manera ventajosa, utilizando la G6PD en relación con la biosíntesis de L-aminoácidos, un ADN que codifica la enzima, un ADN recombinante obtenido insertando el ADN en un vector o un transformante que comprende el ADN recombinante, para incrementar de ese modo aún más la productividad de L-aminoácidos de un microorganismo.
En el contexto de la presente invención se ha aislado con éxito un ADN que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº:2, y se ha determinado que puede utilizarse en la producción de L-aminoácidos. Asimismo, como resultado de estudios exhaustivos, se ha determinado que un polipéptido en el que el aminoácido Ala de la posición 213 de la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº:2 es sustituido por otro aminoácido y que presenta actividad G6PD puede aumentar todavía más la productividad del L-aminoácido. Por lo tanto, la presente invención ha cumplido con su objetivo. En particular, la presente invención se refiere a los elementos (1) a (21) siguientes y se caracteriza en las reivindicaciones adjuntas.
Reivindicaciones:
1. ADN que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de entre el grupo constituido por:
2. Polipéptido que está codificado por el ADN según la reivindicación 1 y que presenta actividad de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa.
3. ADN recombinante que puede obtenerse insertando el ADN según la reivindicación 1 en un vector.
4. ADN recombinante según la reivindicación 3, en el que el ADN recombinante puede replicarse en un microorganismo perteneciente al género Escherichia o el género Corynebacterium.
5. Plásmido pCRBzwfM comprendido en Escherichia coli TOP10 (FERM BP-7135).
6. Transformante que se puede obtener introduciendo el plásmido recombinante o el ADN recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5 en una célula huésped.
7. Transformante según la reivindicación 6, en el que la célula huésped es un microorganismo que puede producir un L-aminoácido.
8. Transformante según la reivindicación 7, en el que la célula huésped es un microorganismo perteneciente al género Escherichia o el género Corynebacterium.
9. Transformante perteneciente al género Escherichia o el género Corynebacterium, que comprende un cromosoma en el cual se integra de manera artificial el ADN según la reivindicación 1.
10. Transformante según la reivindicación 8 ó 9, en el que el microorganismo que pertenece al género Corynebacterium es el Corynebacterium glutamicum.
11. Procedimiento para producir un polipéptido según la reivindicación 2, que comprende el cultivo del transformante según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10 en un medio para formar y acumular el polipéptido en un cultivo, y la recuperación del polipéptido del cultivo.
12. Procedimiento para producir un L-aminoácido, que comprende el cultivo del transformante según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10 en un medio para formar y acumular el L-aminoácido que se biosintetiza utilizando NADPH en el cultivo, y la recuperación del L-aminoácido del cultivo.
13. Procedimiento para producir un L-aminoácido según la reivindicación 12, en el que el L-aminoácido que se biosintetiza utilizando NADPH se selecciona de entre L-lisina, L-treonina, L-isoleucina, L-triptófano, L-fenilalanina, L-tirosina, L-histidina y L-cisteína.
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