Un mutante de sustitución de IL-18 humana, en el que dicho mutante comprende de tres a cinco sustituciones de aminoácidos en la secuencia de la SEC ID Nº:

1, estando dichas sustituciones en tres a cinco restos aminoacídicos elegidos entre el grupo de: la cisteína en el resto 38, la cisteína en el resto 68, la cisteína en el resto 76, la asparagina en el resto 78, el ácido glutámico en el resto 121, la cisteína en el resto 127, la leucina en el resto 144 y el ácido aspártico en el resto 157, y en el que dicho mutante contiene al menos:

(a)una serina en lugar de cisteína en el resto 38, un ácido aspártico en lugar de cisteína en el resto 68 y una cisteína en lugar de asparagina en el resto 78 (SEC ID Nº: 5),

(b)una serina en lugar de cisteína en el resto 38, un ácido aspártico en lugar de cisteína en el resto 68 y una cisteína en lugar de ácido glutámico en el resto 121 (SEC ID Nº: 6),

(c)una serina en lugar de cisteína en el resto 38, un ácido aspártico en lugar de cisteína en el resto 68 y una cisteína en lugar de leucina en el resto 144 (SEC ID Nº: 7) o

(d)una serina en lugar de cisteína en el resto 38, un ácido aspártico en lugar de cisteína en el resto 68 y una cisteína en lugar de ácido aspártico en el resto 157 (SEC ID Nº: 8)

Mutantes de sustitución de IL-18 humana y sus conjugados.

Campo de la invención

La presente invención se refiere al campo de la conjugación de proteínas con especificidad de sitio. Más específicamente, la presente invención se refiere a la conjugación de polímeros solubles en agua con mutantes de sustitución de polipéptidos de la interleucina-18 humana (en el presente documento "IL-18").

Antecedentes de la invención

La unión covalente de compuestos biológicamente activos a polímeros solubles en agua es un procedimiento para la alteración y el control de la biodistribución, farmacocinética y, con frecuencia, toxicidad de estos compuestos (Duncan, R. y Kopecek, J. (1984) Adv. Polym. Sci. 57: 53-101). Para conseguir estos efectos se han usado muchos polímeros solubles en agua tales como poli(ácido siálico), dextrano, poli(N-(2-hidroxipropil)metacrilamida) (PHPMA), poli(N-vinilpirrolidona) (PVP), poli(alcohol vinílico) (PVA), poli(etilenglicol-co-propilenglicol), poli(N-acriloil morfolina) (PAcM) y poli(etilenglicol) (PEG) (Powell, G. M. (1980) Polyethylene glycol. En R.L. Davidson (Ed.) HANDBOOK OF WATER SOLUBLE GUMS AND RESINS: McGraw-Hill, New York, capítulo 18). El PEG posee una serie ideal de propiedades: una toxicidad muy baja (Pang, S. N. J. (1993) J. Am. Coll. Toxicol. 12: 429-456) excelente solubilidad en solución acuosa (Powell, mencionado anteriormente), baja inmunogenicidad y antigenicidad (Dreborg, S. y Akerblom, E. B. (1990) Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 6: 315-365). En la bibliografía científica se han descrito agentes terapéuticos constituidos por una proteína conjugada con PEG o "PEGilados", que contienen una sola o múltiples cadenas de polietilenglicol en la proteína (Clark, R., y col. (1996) J. Biol. Chem. 271: 21969-21977; Hershfield, M. S. (1997) Biochemistry and immunology of poly(ethylene glycol)-modified adenosine deaminase (PEG-ADA). In J. M. Harris y S. Zalipsky (Eds) Poly(ethylene glycol): Chemistry and Biological Applications. American Chemical Society, Washington, DC, p145-154; Olson, K., y col. (1997) Preparation and characterization of poly(ethylene glycol)ylated human growth hormone antagonist. En J. M. Harris y S. Zalipsky (Eds) Poly(ethylene glycol): Chemistry and Biological Applications. American Chemical Society, Washington, DC, p170- 181).

Las proteínas conjugadas tienen numerosas ventajas con respecto a sus homólogos no modificados. Por ejemplo, la modificación con PEG ha prolongado la semivida plasmática de muchas proteínas (Francis, G.E., y col. (1992) PEG-modified proteins. En: STABILITY OF PROTEIN PHARMACEUTICALS: in vivo PATHWAYS OF DEGRADATION AND STRATEGIES FOR PROTEIN STABILIZATION (ed. por T.J. Ahern y M. Manning). Plenum Press, New York). En la base de este aumento están implicados varios factores. El mayor tamaño del conjugado modificado con PEG reduce la filtración glomerular cuando se excede el umbral de 70 kD (Futertges, F. y Abuchowski, A. (1990) J. Controlled Release 11: 139-148). También se reduce la eliminación por el sistema reticuloendotelial a través de receptores de carbohidrato e interacciones proteína-receptor (Beauchamp, C.O., y col. (1983) Anal. Biochem. 131: 25-33). La reducción de la proteolisis (Chiu, H.C., y col. (1994) J. Bioact. Comp. Polym. 9: 388-410) también puede contribuir a una mayor semivida. También se reducen la antigenicidad e inmunogenicidad (Nucci, M. L., y col. (1991) Adv. Drug Del. Rev. 6: 133-151) y esto explica la reducción de las reacciones que ponen en peligro la vida después de una dosificación repetida. La combinación de todos estos factores conduce a una mayor biodisponibilidad in vivo (Katre, N. V., y col. (1987) PNAS USA 84: 1487-1491; Hershfield, M. S., y col. (1987) New England Journal of Medicine 316: 589-596) y esto podría ser muy importante en el uso de aductos de PEG-citocina como agentes farmacológicos. La dosis puede reducirse (para aliviar la toxicidad) y puede desarrollarse un programa de dosificación más conveniente.

La IL-18 es un monómero no glicosilado de 18 Kd con una estructura primaria relacionada muy estrechamente con la IL-1a de la subfamilia IL-1ß-trefoil. El ADNc de la IL-18 murina y humana codifica una proteína precursora constituida por 192 y 193 aminoácidos, respectivamente. La homología entre la IL-18 humana y murina es del 65%. La Pro-IL-18 requiere procesamiento por caspasas, tales como ICE (caspasa-1) o caspasa-4, para dar la proteína madura bioactiva (157 aminoácidos) para mediar la actividad biológica. La actividad de la IL-18 está mediada por un complejo de receptor de IL-18 (IL-18R) (constituido por una cadena de unión (IL-18Ra) y una cadena de señalización (IL-18Rß)). Las actividades biológicas de la IL-18 que respaldan su potencial terapéutico para inmunoterapia de tumores incluyen la inducción y producción de IFN?• y GM-CSF, la potenciación y promoción de la actividad citolítica de las células NK y la diferenciación de células T vírgenes en células Th1. En respuesta a la IL-18, se generan linfocitos T citotóxicos (CTL) y células de memoria que presentan una potente actividad antitumoral. Otras funciones reguladoras incluyen la regulación positiva de la expresión del ligando Fas funcional (FasL) en células NK y T (lo que sugiere que la actividad antitumoral de la IL-18 está mediada en parte por la interacción de Fas-FasL, que induce la apoptosis tumoral); la activación de monocitos/macrófagos y células B y anti-angiogénesis.

La proteína de unión a IL-18 (IL-18BP) es una proteína circulante soluble natural que se ha descrito recientemente como antagonista de la IL-18. La IL-18BP no tiene homología significativa con el receptor de IL-18, ya que contiene un solo supuesto dominio de Ig que tiene una homología muy limitada con el tercer dominio de Ig del receptor de IL-1 de tipo II. Puede encontrarse una homología mucho mayor con IL-18BP en una familia de proteínas codificadas por varios poxvirus (virus de la viruela porcina, virus de la viruela bovina, virus variola, virus del molluscum contagiosum y virus de la ectromelia). Los poxvirus codifican receptores señuelo de muchas citocinas y estos receptores son instrumentales en la elusión viral de respuestas inmunes. Como la IL-18 es una de las primeras señales que conducen a la producción de IFN? por células Th I, el bloqueo de la actividad de la IL-18 por IL-18BP puede estar implicado en la regulación negativa de una de las primeras fases de la respuesta inmune. Los niveles elevados de IL-18BP podrían ser perjudiciales para la eficacia de la terapia con IL-18 recombinante.

Como único agente, una forma recombinante de la IL-18 murina estimuló el sistema inmune murino, dando como resultado regresiones tumorales parciales y completas y/o la inducción de memoria inmunológica en diversos modelos tumorales establecidos. En combinación con agentes quimioterapéuticos usados comúnmente en situación clínica, tal como el topotecan, la IL18 murina demostró un efecto sinérgico que daba como resultado mayor eficacia a nivel local y/o sistémico en diversos modelos de tumor establecidos. Se investigaron posibles biomarcadores de la actividad de IL-18 para correlacionarlos con acontecimientos tempranos de la activación inmune mediada por IL-18, junto con estudios de envergadura sobre la toxicología y farmacocinética de las formas recombinantes de IL-18 murina e IL-18 humana de la IL-18. Estos datos preclínicos respaldan el desarrollo clínico de la IL-18 humana como una nueva forma de inmunoterapia, o como un adyuvante para vacunas para cánceres, o un adyuvante de agentes citotóxicos y otros agentes biológicos tales como el topotecan y la IL-2 respectivamente, para el tratamiento de pacientes que padecen diferentes tipos de cánceres.

El documento EP-A-845 530 desvela un mutante de IL-18 que tiene al menos uno de los restos de cisteína en las posiciones 36, 68, 76 y 127 sustituidas por preferentemente un resto de serina o un resto de alanina.

Sumario de la invención

En un primer aspecto, la presente invención proporciona un mutante de sustitución de IL-18 humana, en el que dicho mutante comprende de tres a cinco sustituciones de aminoácidos en la secuencia de la SEC ID Nº: 1, siendo dichas sustituciones de tres a cinco restos aminoacídicos elegidos del grupo de: la cisteína en el resto 38, la cisteína en el resto 68, la cisteína en el resto 76, la asparagina en el resto 78, el ácido glutámico en el resto 121, la cisteína en el resto 127, la leucina en el resto 144 y el ácido aspártico en el resto 157, y en el que dicho mutante contiene al menos:

1. Un mutante de sustitución de IL-18 humana, en el que dicho mutante comprende de tres a cinco sustituciones de aminoácidos en la secuencia de la SEC ID Nº: 1, estando dichas sustituciones en tres a cinco restos aminoacídicos elegidos entre el grupo de: la cisteína en el resto 38, la cisteína en el resto 68, la cisteína en el resto 76, la asparagina en el resto 78, el ácido glutámico en el resto 121, la cisteína en el resto 127, la leucina en el resto 144 y el ácido aspártico en el resto 157, y en el que dicho mutante contiene al menos:

2. Una composición biológicamente activa que comprende un polipéptido conjugado con un polímero soluble en agua, en la que el polipéptido es un mutante de sustitución de IL-18 humana elegido entre el grupo de la SEC ID Nº: 5, SEC ID Nº: 6, SEC ID Nº: 7, SEC ID Nº: 8, SEC ID Nº: 9 y SEC ID Nº: 10.

3. La composición de acuerdo con la reivindicación 2, en la que la conjugación entre el polipéptido y el polímero es covalente.

4. La composición de acuerdo con la reivindicación 2 ó 3, en la que el polímero soluble en agua es un miembro elegido entre el grupo de: homopolímeros de polietilenglicol, copolímeros de polietilenglicol, homopolímeros de polipropilenglicol, poli(N-vinilpirrolidona) poli(alcohol vinílico), poli(etilenglicol-co-propilenglicol), poli(N-2-(hidroxipropil)metacrilamida), poli(ácido siálico), poli(N-acriloil morfolina) y dextrano.

5. La composición de acuerdo con la reivindicación 4, en la que el polímero soluble en agua no está sustituido.

6. La composición de acuerdo con la reivindicación 4, en la que el polímero soluble en agua está sustituido en un extremo con un grupo alquilo.

7. La composición de acuerdo con la reivindicación 4, en la que el polímero soluble en agua es un homopolímero de polietilenglicol.

8. La composición de acuerdo con la reivindicación 7, en la que el homopolímero de polietilenglicol es monometoxi-polietilenglicol.

9. La composición de acuerdo con la reivindicación 8, en la que el monometoxi-polietilenglicol se elige entre el grupo de monometoxi-polietilenglicol lineal y monometoxi-polietilenglicol ramificado.

10. La composición de acuerdo con la reivindicación 9, en la que el homopolímero de polietilenglicol tiene un peso molecular de aproximadamente 20.000 a aproximadamente 40.000 daltons.

11. La composición de acuerdo con la reivindicación 10, en la que el homopolímero de polietilenglicol tiene un peso molecular de aproximadamente 20.000 daltons.

12. La composición de acuerdo con la reivindicación 10, en la que el homopolímero de polietilenglicol tiene un peso molecular de aproximadamente 30.000 daltons.

13. La composición de acuerdo con la reivindicación 10, en la que el homopolímero de polietilenglicol tiene un peso molecular de aproximadamente 40.000 daltons.

14. Uso de una composición de acuerdo con la reivindicación 10 en la fabricación de un medicamento para tratar cáncer.

15. El uso de acuerdo con la reivindicación 14 en el que el cáncer comprende un tumor inmunosensible elegido entre el grupo de carcinoma de células renales, mieloma, linfoma y melanoma.

16. Una composición de acuerdo con la reivindicación 10 para su uso en el tratamiento de cáncer.

17. Una composición de acuerdo con la reivindicación 16, en la que el cáncer comprende un tumor inmunosensible elegido entre el grupo de: carcinoma de células renales, mieloma, linfoma y melanoma.

18. La composición de acuerdo con la reivindicación 2, en la que el mutante de sustitución de IL-18 humana tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 5, y en la que el mutante está conjugado con el polímero soluble en agua en la cisteína del resto 78.

19. La composición de acuerdo con la reivindicación 2, en la que el mutante de sustitución de IL-18 humana tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 6, y en la que el mutante está conjugado con el polímero soluble en agua en la cisteína del resto 121.

20. La composición de acuerdo con la reivindicación 2, en la que el mutante de sustitución de IL-18 humana tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 7, y en la que el mutante está conjugado con el polímero soluble en agua en la cisteína del resto 144.

21. La composición de acuerdo con la reivindicación 2, en la que el mutante de sustitución de IL-18 humana tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 8, y en la que el mutante está conjugado con el polímero soluble en agua en la cisteína del resto 157.

22. La composición de acuerdo con la reivindicación 2, en la que el mutante de sustitución de IL-18 humana tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 9, y en la que el mutante está conjugado con el polímero soluble en agua en la cisteína del resto 144.

23. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 18, 19, 20, 21 ó 22, en la que el polímero soluble en agua se elige entre el grupo de: homopolímero de polietilenglicol lineal que tiene un peso molecular de aproximadamente 20.000 a aproximadamente 40.000 daltons y homopolímero de polietilenglicol ramificado que tiene un peso molecular de aproximadamente 20.000 a aproximadamente 40.000 daltons.

24. La composición de acuerdo con la reivindicación 23, en la que el homopolímero de polietilenglicol lineal tiene un peso molecular de aproximadamente 20.000 daltons.

25. La composición de acuerdo con la reivindicación 2, en la que el mutante de sustitución de IL-18 humana tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 10 y en la que el mutante está conjugado con el polímero soluble en agua en la cisteína del resto 157.

26. La composición de acuerdo con la reivindicación 25, en la que el polímero soluble en agua es homopolímero de polietilenglicol lineal que tiene un peso molecular de aproximadamente 20.000 a aproximadamente 40.000 daltons.

27. La composición de acuerdo con la reivindicación 26, en la que el homopolímero de polietilenglicol lineal tiene un peso molecular de aproximadamente 20.000 daltons.