MOLECULAS DIANA QUIMERICAS QUE TIENEN UNA ACTIVIDAD REGULABLE.

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UNA MOLECULA DIANA QUMERICA QUE TIENE UNA ACTIVIDAD QUE SE PUEDE REGULAR O MODULAR MEDIANTE UNA MOLECULA DE UNION.

LA INVENCION SE REFIERE ASIMISMO A PROCEDIMIENTOS DE UTILIZACION DE DICHA MOLECULA DIANA QUIMERICA PARA DETECTAR LA PRESENCIA Y/O CANTIDAD DE UN ANALITO DESEADO EN UNA MUESTRA. DICHO ANALITO ES UNA MOLECULA DE UNION, O UN COMPETIDOR DE UNA MOLECULA DE UNION, EL CUAL, TRAS LA UNION A LA MOLECULA DIANA, ALTERA LA ACTIVIDAD DE LA MISMA DE FORMA DETECTABLE. EN UN ASPECTO DE LA INVENCION, UNA MOLECULA DE UNION SE UNE A LA MOLECULA QUIMERICA, INACTIVANDOLA. UN ANALITO EN UNA MUESTRA DE ENSAYO, COMPITE Y/O DESPLAZA LA MOLECULA DE UNION DE LA QUIMERA, REACTIVANDOLA. LA REAPARICION DE ACTIVIDAD EN PRESENCIA DEL ANALITO, INDICA SU PRESENCIA EN LA MUESTRA DE ENSAYO, Y SU CANTIDAD. OTRO ASPECTO DE LA INVENCION SE REFIERE A UNA MOLECULA DE UNION QUE REGULA UNA MOLECULA DIANA QUIMERICA, Y A PROCEDIMIENTOS DE PRODUCCION DE LA MISMA

Moléculas diana quiméricas que tienen una actividad regulable.

El desarrollo de ensayos para medición de la presencia y cantidad de sustancias deseadas es sumamente deseable para una diversidad de propósitos, que incluyen usos médicos, veterinarios, de investigación, y ambientales. Adicionalmente, es deseable diseñar y aislar moléculas que tengan una actividad que sea regulable por una sustancia deseada. Estas moléculas regulables son útiles para detectar la cantidad y presencia de un analito deseado, utilizando la capacidad del analito para regular directa o indirectamente (v.g., por competición) la actividad de la molécula.

J. Biol. Chem. 271 (agosto 1996), páginas 21251-21256 describe la actividad de ß-galactosidasa como sonda molecular para detectar anticuerpos específicos.

P.N.A.S. USA 92 (junio 1995), páginas 5783-5787 describe un sistema sensor molecular basado en fosfatasa alcalina manipulada genéticamente.

Prot. Eng. 7 (abril 1994), páginas 509-514, describe la modulación de la actividad enzimática por fijación de anticuerpos a una proteína híbrida fosfatasa alcalina-epítope.

WO 92/07090 describe métodos para modificar y detectar los efectos sobre la interacción de polipéptidos modificados y sustratos diana.

La presente invención proporciona un método para determinar la presencia o cantidad de un analito en una muestra de test, que comprende: Un método para determinar la presencia o cantidad de un analito en una muestra de test, que comprende: (a) preparar ácidos nucleicos que codifican una enzima quimérica, en donde la actividad de la enzima quimérica se modula por fijación de una molécula de fijación, en donde dichos ácidos nucleicos se preparan por un método que comprende: (i) proporcionar bibliotecas de oligonucleótidos sintéticos degenerados que codifican mimotopos; (ii) expresar una biblioteca de enzimas quiméricas candidato preparadas por inserción de dichos oligonucleótidos en secuencias de ácido nucleico que codifican una enzima de partida para producir enzimas quiméricas candidato; (iii) proporcionar una molécula de fijación; (iv) cribar las enzimas quiméricas candidato expresadas para determinar si la actividad de la enzima quimérica candidato se modula por fijación de dicha molécula de fijación a dicha enzima quimérica candidato e identificar al menos una enzima quimérica con actividad modulada; y (v) aislar ácidos nucleicos que codifican dicha enzima quimérica de dicha biblioteca; (b) expresar un ácido nucleico preparado de acuerdo con la parte (a) para producir una enzima quimérica; (c) poner en contacto la enzima quimérica con (1) la muestra de test, (2) una molécula de fijación que se fija a un mimotopo de la enzima quimérica, y (3) un sustrato sobre el cual actúa catalíticamente la enzima quimérica, para formar una mezcla de reacción; y (d) detectar la cantidad de catálisis del sustrato producida por la enzima quimérica, en donde la molécula de fijación modula la catálisis por la enzima quimérica en donde dicho analito actúa como competidor directo de la interacción de la enzima quimérica con la molécula de fijación.

La presente invención proporciona también un método para determinar la presencia o cantidad de un analito en una muestra de test, que comprende: (a) preparar una enzima quimérica por un método como se define en las partes (a) y (b) de la reivindicación 1; (b) poner en contacto la enzima quimérica con (1) la muestra de test y (2) un sustrato sobre el cual actúa catalíticamente la enzima quimérica, para formar una mezcla de reacción; y (c) detectar la cantidad de catálisis del sustrato producida por la enzima quimérica, en donde el analito modula la catálisis por la enzima quimérica.

La Solicitud describe una molécula diana quimérica que tiene una actividad que puede ser regulada o modulada por una molécula de fijación. La invención se refiere a métodos de utilización de la molécula diana quimérica para detectar la presencia y/o cantidad de un analito deseado en una muestra. El analito es una molécula de fijación, o un ligando de una molécula de fijación, molécula que, después de fijación a la molécula diana, altera la actividad de la molécula diana de una manera detectable. En un aspecto de la invención, una molécula de fijación se fija a la molécula quimérica, desactivándola. Un analito en una muestra de test compite y/o desplaza la molécula de fijación de la quimera, reactivándola. La reaparición de actividad en presencia del analito indica su existencia y cantidad en la muestra de test. Otro aspecto de la invención se refiere a una molécula de fijación que regula una molécula diana quimérica y métodos de producción de la misma.

De acuerdo con la presente invención, una molécula diana (TM) deseada puede modificarse para obtener al menos un resto de sitio de fijación (BSM) al cual puede fijarse una molécula de fijación (BM). Después de la fijación de la BM al BSM, una actividad asociada con la TM se altera de una manera detectable, v.g., aumentando o reduciendo la actividad de la TM. Así, el BSM puede actuar como conmutador de regulación, encendiendo o apagando (totalmente o en parte) una actividad de una TM deseada en respuesta a la fijación de una BM. El BSM puede seleccionarse también de tal manera que la fijación de la molécula de fijación regula la activación de la molécula diana. De acuerdo con la presente invención, un mimotopo es el BSM preferido. Un BSM puede manipularse genéticamente en una molécula diana por la inserción de secuencias, por el reemplazamiento de secuencias presentes en una molécula con nuevas secuencias, por mutagénesis de secuencias ya presentes en la molécula, etc. La manipulación genética puede realizarse de acuerdo con métodos disponibles para el operario experto.

El término molécula diana "quimérica", v.g., una "enzima quimérica" significa el producto resultante después que el resto del sitio de fijación ha sido insertado en la molécula diana o después que una porción de la molécula diana ha sido reemplazada por el resto del sitio de fijación. Para mayor claridad, se hace referencia a la molécula diana antes de la manipulación genética del BSM, como la molécula diana de partida. Así, si una enzima es el material de partida, se hace referencia a la misma como la "enzima de partida". Después de la manipulación del BSM por manipulación genética, la enzima de partida se identifica como una "enzima quimérica". En los ejemplos que siguen, se utiliza ß-lactamasa como una enzima de partida en la cual se manipula genéticamente un resto de sitio de fijación que comprende aminoácidos, para producir una enzima quimérica. La misma es quimérica, dado que está constituida por aminoácidos de la enzima de partida y aminoácidos de un resto del sitio de fijación.

El término "molécula de fijación" significa una molécula que se fija o une específicamente a un resto del sitio de fijación. Por el término "específico", se entiende que la molécula de fijación reconoce la secuencia de aminoácidos definida dentro de o que incluye la secuencia de aminoácidos del resto del sitio de fijación. La especificidad puede ser una función de la secuencia lineal de aminoácidos del resto del sitio de fijación, sola, o en combinación con aminoácidos presentes originariamente en la molécula diana o en una inserción o reemplazamiento en otro sitio. Pueden emplearse diversas moléculas de fijación, que incluyen anticuerpos, polipéptidos, aptámeros, ácidos nucleicos, fármacos, y ligandos químicos. Los anticuerpos pueden ser monoclonales, policlonales, monocatenarios, anticuerpos manipulados genéticamente, etc., como es conocido en la técnica. Véase, v.g., Reiter et al., Nature Biotechnology, 14:1239-1245, 1996; Bird et al., Science, 242:423-426, 1988.

Una molécula de fijación puede fijarse a una porción específica de una macromolécula denominada un epítope o un determinante. El epítope puede ser un determinante lineal o un determinante estructural. Véase, v.g., Abbas et al., Cellular and Molecular Immunology, segunda edición, W.B. Saunders Co., 1991, especialmente las páginas 47-49. Un "mimotopo" es un determinante que es reconocido por la misma molécula de fijación como un "epítope" particular, pero que tiene una composición diferente del "epítope". Por ejemplo, una molécula de fijación puede ser un anticuerpo que reconoce (es decir, se fija a) un epítope que comprende una secuencia de aminoácidos lineal. Un "mimotopo" de este epítope comprende una secuencia lineal diferente de aminoácidos pero que es todavía reconocida...

1. Un método para determinar la presencia o cantidad de un analito en una muestra de test, que comprende:

(a) preparar ácidos nucleicos que codifican una enzima quimérica, en donde la actividad de la enzima quimérica se modula por fijación de una molécula de fijación, en donde dichos ácidos nucleicos se preparan por un método que comprende:

(b) expresar un ácido nucleico preparado de acuerdo con la parte (a) para producir una enzima quimérica;

(c) poner en contacto la enzima quimérica con (1) la muestra de test, (2) una molécula de fijación que se fija a un mimotopo de la enzima quimérica, y (3) un sustrato sobre el cual actúa catalíticamente la enzima quimérica, para formar una mezcla de reacción; y

(d) detectar la cantidad de catálisis del sustrato producida por la enzima quimérica, en donde la molécula de fijación modula la catálisis por la enzima quimérica en donde dicho analito actúa como competidor directo de la interacción de la enzima quimérica con la molécula de fijación.

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el cual la molécula de fijación es un anticuerpo.

3. Un método para determinar la presencia o cantidad de un analito en una muestra de test, que comprende:

(a) preparar una enzima quimérica por un método como se define en las partes (a) y (b) de la reivindicación 1;

(b) poner en contacto la enzima quimérica con (1) la muestra de test y (2) un sustrato sobre el cual actúa catalíticamente la enzima quimérica, para formar una mezcla de reacción; y

(c) detectar la cantidad de catálisis del sustrato alcanzada por la enzima quimérica, en donde el analito modula la catálisis por la enzima quimérica.

4. En método de acuerdo con la reivindicación 3, en el cual el analito y el sustrato se ponen en contacto con la enzima quimérica simultáneamente.

5. Un método de acuerdo con la reivindicación 3, en el cual el analito se pone en contacto con la enzima quimérica antes del contacto del sustrato con la enzima quimérica.

6. Un método de acuerdo con la reivindicación 3, en el cual el analito es un anticuerpo.

7. Un método de acuerdo con la reivindicación 3, en el cual la enzima de partida es ß-lactamasa.

8. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 ó 3, en el cual la muestra de test contiene el analito.

9. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el cual el analito es antígeno específico de próstata.

10. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 ó 3, en el cual la muestra de test es suero.

11. Un método de acuerdo con la reivindicación 3, en el cual el analito es un anticuerpo específico para el antígeno específico de próstata.