CÉLULAS MADRE HEPÁTICAS AISLADAS.

Una célula progenitora o célula madre humana aislada originada a partir de hígado adulto humano,

caracterizada porque: (a) expresa el marcador mesenquimal α-actina de músculo liso (ASMA), (b) expresa el marcador de hepatocito albúmina (ALB), y (c) es negativo para citoqueratina 19 (CK-19)

Campo de la invención

La presente invención se refiere a células progenitoras o células madre hepáticas aisladas, originados a partir de hígado adulto, y a su uso en medicina, hepatología, errores congénitos del metabolismo hepático, transplante, enfermedades infecciosas e insuficiencia hepática. La presente invención se refiere también a procedimientos de aislamiento de estas células y a su uso para transplante, dispositivos de órganos artificiales, toxicología y farmacología.

Antecedentes de la invención

El hígado es un órgano clave que efectúa muchas funciones vitales tales como homeostasis de glucosa, detoxificación de xenobióticos o síntesis de macromoléculas. Por tanto, el deterioro de una de las múltiples funciones hepáticas podría tener un impacto drástico sobre la salud. La incidencia mundial de enfermedades hepáticas agudas o crónicas establece a estas patologías entre la 5ª y 9ª causa de muerte, según la Organización Mundial de la Salud. Hasta ahora, el único tratamiento curativo para enfermedades hepáticas terminales sigue siendo el transplante de hígado. El desenlace para pacientes que se sometieron a sustitución hepática quirúrgica es bastante bueno, con más de un 95% de recuperación. Sin embargo, a pesar de las nuevas técnicas quirúrgicas que incluyen transplante parcial de hígado y de pariente vivo, la creciente escasez de órganos conduce a una mayor mortalidad en la lista de espera. Por lo tanto, es un objetivo importante en la investigación de la medicina de transplantes la demostración del uso potencial de células hepáticas en regeneración hepática y el tratamiento de enfermedades hepáticas.

El transplante de células hepáticas (TCH) es un procedimiento emergente que implica la infusión de una suspensión de células hepáticas en el sistema portal del receptor. Está orientado a la recuperación de la función hepática del receptor como consecuencia del injerto y repoblación del parénquima enfermo. El TCH se validó por primera vez en modelos animales en los que se había demostrado que los hepatocitos singénicos podían sobrevivir indefinidamente y ser capaces de corregir diversos defectos enzimáticos (para revisión, véase Najimi y Sokal. 2005. Minerva Pediatr. 57 (5): 243-57).

En seres humanos, los estudios anteriores se habían diseñado para el tratamiento de insuficiencia hepática aguda. Estos estudios alentaron a los facultativos a extender el TCH a indicaciones adicionales y hasta ahora se han notificado al menos 30 casos en todo el mundo para diversos defectos (Strom y col. 1997. Transplant Proc. 29 (4): 2103-6). En el campo específico de las enfermedades metabólicas, 13 casos notificaron el uso de hepatocitos para el tratamiento, entre otros, del síndrome de Crigler-Najjar de tipo I, defectos del ciclo de la urea o enfermedades raras tales como, por ejemplo, enfermedad de Refsum infantil. Estos estudios demostraron el injerto de los hepatocitos en el parénquima y en consecuencia una mejora del estado del paciente hasta 18 meses después del transplante.

Sin embargo, debido a que el suministro de hepatocitos humanos maduros para transplantes es aún limitado, de hecho más o menos tan limitado como la disponibilidad del hígado completo, la investigación está también orientada a obtener células transplantables de otras fuentes, tales como células progenitoras y citoblastos, por ejemplo de origen embriónico o adulto, que podrían ser multiplicables, por ejemplo in vitro, y ser capaces de diferenciarse en hepatocitos maduros funcionales, especialmente in vivo después del transplante. En consecuencia, hay una gran necesidad de desarrollar nuevos medios que sean útiles en el tratamiento de diversas enfermedades o afecciones asociadas a enfermedades asociadas al hígado, particularmente dados los tratamientos inadecuados disponibles actualmente para la mayoría de estos trastornos.

Históricamente, se creía que los células madre embrionarias (CME) estaban implicados solo en la organogénesis, debido a su división clonal ilimitada observada y a la diferenciación pluripotente en células derivadas de tejidos completos. Por otro lado, los procesos de regeneración en órganos adultos estaban típicamente adscritos a las células progenitoras adultas. No obstante, se ha revisado esta teoría a la vista del descubrimiento de citoblastos en órganos adultos que expresan marcadores embrionarios conocidos. Por tanto, las caracterizaciones de citoblastos y células progenitoras están basadas ahora no solo en el proceso de desarrollo (embrionario frente a adulto), sino también en la presencia de marcadores celulares específicos en los mismos. Es más, la expresión de marcadores celulares, tales como proteínas de membrana o factores de transcripción, puede variar a lo largo de las rutas de diferenciación y reflejar diversos estímulos (por ejemplo, estímulos ambientales) y necesidades celulares. A menudo, se observa que, en el transcurso de un proceso de diferenciación, un citoblasto dejará gradualmente de exhibir marcadores indicativos de su pluripotencia, por ejemplo Oct-4, y será capaz de expresar marcadores atribuibles a etapas posteriores, por ejemplo, marcadores de un linaje específico. Como ejemplo no limitante, puede perderse progresivamente Oct-4 durante la maduración y, por otro lado, las células que entran en el linaje endodérmico pueden empezar a expresar α-fetoproteína.

**(Ver fórmula)**

Con respecto a la regeneración hepática mediante transplante de células, pueden considerarse varios tipos de célula fuente posibles. Por ejemplo, se esperaría que los CE fueran capaces de regenerar cualquier órgano debido a su pluripotencia. Es más, este camino está extensamente explorado en la técnica. Sin embargo, los CE tienden a generar crecimiento tumoral cuando se introducen en cualquier tejido distinto de útero. Por lo tanto, su uso in vivo continúa limitado por el riesgo de desviación carcinogénica. Incluso una diferenciación exitosa in vitro anterior de los CE podría no ser suficientemente segura para considerar la inoculación humana.

Sería una alternativa más segura el uso de células progenitoras adultas que, al contrario que los CE, tienden a presentar una capacidad limitada de división clonal y su diferenciación da lugar a células derivadas con destinos más limitados. En el hígado, se han descrito progenitoras adultas tales como células ovales (precursoras de colangiocitos y hepatocitos) o células de tipo hepatocito pequeñas. Sin embargo, su uso médico se hace difícil por su escasez en órganos adultos normales.

Por consiguiente, representarían una gran mejora en las fuentes de transplante de células citoblastos adultos que mostraran capacidad de división clonal con riesgo reducido o ausente de desviación carcinogénica. Se están evaluando actualmente varios tipos de citoblastos adultos en estudios de transplante de células hepáticas. Por ejemplo, se están estudiando mesenquimalcélulas madre mesenquimales (CM) de sangre periférica o de cordón umbilical debido a su capacidad de transdiferenciarse en células maduras adicionales de otro linaje. Además, los citoblastos hematopoyéticos de médula se han estudiado también en términos de potencias de regeneración hepática.

Aunque la caracterización in vitro de citoblastos adultos sigue presentando dificultades, se acepta actualmente en el campo que dicha caracterización puede implicar ventajosamente detectar (i) marcadores de su origen o linaje embriónico (especialmente mesodérmico, endodérmico, ectodérmico o hematopoyético), (ii) la expresión de marcadores que reflejen el nivel de diferenciación y por tanto en cierta medida predictivos de las diferentes progenies posibles, y (iii) el destino in vitro o in vivo después de la diferenciación. Por consiguiente, la caracterización y distinción de citoblastos adultos obtenibles a partir de hígado normal puede implicar ventajosamente la evaluación de la presencia o ausencia de (i) marcadores que reflejen el origen embriónico complejo de este órgano, (ii) marcadores de diferenciación (por ejemplo, de la presencia de albúmina) y (iii) al menos un marcador indicativo del destino del citoblasto.

Según el conocimiento actual, el hígado se origina principalmente a partir del endodermo y los hepatocitos son parte del linaje endodérmico. Sin embargo, la formación de células hepáticas implica también la interacción entre el epitelio endodérmico y el mesodermo cardiogénico. Además, en el desarrollo fetal, la hematopoyesis tiene lugar también en el hígado. Dada esta interacción durante el desarrollo,... [Seguir leyendo]

1. Una célula progenitora o célula madre humana aislada originada a partir de hígado adulto humano, caracterizada porque:

(a) expresa el marcador mesenquimal α-actina de músculo liso (ASMA),

(b) expresa el marcador de hepatocito albúmina (ALB), y

(c) es negativo para citoqueratina 19 (CK-19).

2. La célula progenitora o célula madre humana aislada según la reivindicación 1, caracterizada porque:

(a) expresa los marcadores CD90, CD73, CD44, vimentina y ASMA,

(b) expresa ALB, y

(c) es negativo para CK-19.

3. La célula progenitora o célula madre humana aislada según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, que expresa adicionalmente CYP3A4.

4. La célula progenitora o célula madre humana aislada según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que expresa adicionalmente uno o más marcadores hepáticos o de hepatocitos elegidos de CD29, α-fetoproteina (AFP), α-1-antitripsina, HNF-4 y transportador MRP2.

5. La célula progenitora o célula madre humana aislada según la reivindicación 4, que expresa CD29, AFP, α-1antitripsina y transportador MRP2.

6. La célula progenitora o célula madre humana aislada según la reivindicación 1, que es positiva para CD90, CD29 y CD44, y que es positiva para albúmina, positiva para vimentina y positiva para α-actina de músculo liso (ASMA), y que es negativa para CD45, CD34, CD117 y CK-19.

7. La célula progenitora o célula madre humana aislada según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicha célula tiene morfología de tipo mesenquimal, que implica cualquiera o todos de crecimiento en monocapas, forma aplanada, citoplasma amplio y núcleos ovoides con uno o dos nucleolos.

8. La célula progenitora o célula madre humana aislada según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicha célula puede diferenciarse en hepatocitos o células de tipo hepatocito y no se diferencia en tipos celulares mesodérmicos.

9. Una línea celular o una población celular que comprende la célula progenitora o célula madre hepática humana aislada según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

10. Una célula progenitora o célula madre hepática adulta humana aislada y una línea celular, depositada el 20 de febrero de 2006 según el Tratado de Budapest en la Colección Coordinada de Microorganimos Belga (BCCM) con número de acceso LMBP 6452CB, y las sublíneas del mismo incluyendo las sublíneas clonales.

11. Un procedimiento para la obtención de una célula progenitora o célula madre humana aislada o una población celular que comprende dicha célula progenitora o célula madre, comprendiendo el procedimiento: (a) disociar, preferiblemente mediante un procedimiento de colagenasa en dos etapas, un hígado adulto o una parte del mismo de un sujeto humano, formando una población de células primarias a partir de dicho hígado adulto o parte del mismo; (b) sembrar la población de células primarias sobre sustrato recubierto con colágeno de tipo I en medio E de Williams que comprende suero fetal de ternera preferiblemente 10% (v/v) , EGF preferiblemente 25 ng/ml, insulina preferiblemente 10 µg/ml y dexametasona preferiblemente 1 µM; (c) permitir la adherencia de las células de la población celular primaria a dicho sustrato durante 24 horas y después de ello cambiar el medio por medio fresco que tiene la composición de (b); (d) cultivar las células en dicho medio de (c) durante 2 semanas, preferiblemente 15 días; (e) cambiar el medio por DMEM rico en glucosa que comprende FCS preferiblemente 10%, y cultivar adicionalmente las células, con lo que las células progenitoras o células madre de la invención surgen y proliferan;

(f) permitir a las células volverse aproximadamente un 70% confluentes y hacer pases de las células al menos una vez y preferiblemente al menos dos veces, sembrándose las células sobre el sustrato como en (b) y cultivándose en un medio como en (e).

12. Una célula progenitora o célula madre hepática adulta humana aislada según la reivindicación 1, una línea celular del mismo y/o una población celular que comprende el mismo, obtenible u obtenido directamente usando el procedimiento de la reivindicación 11.

13. Una composición que comprende la célula progenitora o célula madre hepática humana según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, 10 o 12, o la línea celular o población celular de cualquiera de las reivindicaciones 9, 10 o

12, opcionalmente en la que dicha composición es una composición farmacéutica que comprende adicionalmente un portador farmacéuticamente aceptable.

14. Las células progenitoras o células madre hepáticas humanas según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, 10 o 12 o la línea celular o población celular de cualquiera de las reivindicaciones 9, 10 o 12 para uso en terapia, preferiblemente para uso en el tratamiento de enfermedad hepática, más preferiblemente para uso en el tratamiento de enfermedad hepática incluyendo fenilcetonuria y otras aminoacidopatías, hemofilia y otras deficiencias de factor de coagulación, hipercolesterolemia familiar y otros trastornos del metabolismo lipídico, trastornos del ciclo de la urea, glucogenosis, galactosemia, fructosemia, tirosinemia, deficiencias del metabolismo de proteínas y carbohidratos, aciduria orgánica, enfermedades mitocondriales, trastornos peroxisómicos y lisosómicos, anormalidades de la síntesis de proteínas, defectos de transportadores de células hepáticas, defecto de glucosilación, hepatitis, cirrosis, errores congénitos del metabolismo, insuficiencia hepática aguda, infecciones hepáticas agudas, toxicidad química aguda, insuficiencia hepática crónica, insuficiencia hepática fulminante, colangitis, cirrosis biliar, síndrome de Alagille, deficiencia de α-1-antitripsina, hepatitis autoinmune, atresia biliar, cáncer de hígado, enfermedad quística del hígado, esteatosis hepática, galactosemia, cálculos biliares, síndrome de Gilbert, hemocromatosis, hepatitis A, hepatitis B, hepatitis C y otras infecciones víricas de hepatitis, porfiria, colangitis esclerosante primaria, síndrome de Reye, sarcoidosis, tirosinemia, enfermedad de almacenamiento de glucógeno de tipo 1 o enfermedad de Wilson.

15. Un procedimiento de realización de un ensayo de toxicidad in vitro que comprende: exponer la célula progenitora o célula madre hepática humana según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, 10 o 12 o una línea celular o población celular según cualquiera de las reivindicaciones 9, 10 o 12 a un agente de ensayo, y observar al menos un efecto, si lo hubiera, del agente de ensayo sobre la población de células hepáticas, preferiblemente en el que el al menos un efecto incluye un efecto sobre la viabilidad celular, la función celular o ambas.

16. Un procedimiento de realización de estudios de metabolismo de fármacos in vitro que comprende: (i) exponer la célula progenitora o célula madre hepática humana según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, 10 o 12 o la línea celular o población celular según cualquiera de las reivindicaciones 9, 10 o 12 a un agente de ensayo, y (ii) observar al menos un cambio, si lo hubiera, que implique al agente de ensayo después de un periodo de ensayo predeterminado, preferiblemente en el que al menos un cambio incluye un cambio en la estructura, concentración o ambas del agente de ensayo.

17. Un dispositivo auxiliar hepático que comprende una carcasa que alberga las células progenitoras o células madre hepáticas humanas según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, 10 o 12 o la línea celular o población celular según cualquiera de las reivindicaciones 9, 10 o 12.

18. La célula progenitora o célula madre hepática humana según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, 10 o 12, o la línea celular o población celular según cualquiera de las reivindicaciones 9, 10 o 12, en los que se ha introducido una copia funcional de un gen, o una composición que comprende dicha célula progenitora o célula madre hepática humana, línea celular o población celular, opcionalmente en los que dicha composición es una composición farmacéutica que comprende adicionalmente un portador farmacéuticamente aceptable, para tratar errores de la expresión génica.

19. La célula progenitora o célula madre hepática humana según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, 10 o 12

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o la línea celular o población celular según cualquiera de las reivindicaciones 9, 10 o 12 para uso en la potenciación de la regeneración de un hígado lesionado o enfermo.

20. Un procedimiento de realización de ensayos de agentes eficaces para tratar infecciones hepáticas que comprende (i) infectar con un agente infeccioso de interés las células progenitoras o células madre hepáticas según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, 10 o 12, o una línea celular o población celular según cualquiera de las reivindicaciones 9, 10 o 12, proporcionando una población infectada, (ii) exponer la población infectada a una cantidad predeterminada de agente de ensayo y (iii) observar los efectos, si los hubiera, de la exposición sobre la población infectada.

21. El procedimiento de la reivindicación 20, en que el agente infeccioso incluye un microorganismo, preferiblemente en el que el agente infeccioso incluye uno o más virus, bacterias, hongos o combinaciones de los mismos, más preferiblemente en el que el agente infeccioso vírico incluye un virus de la hepatitis.

22. El procedimiento de la reivindicación 20, en que los efectos observados incluyen efectos sobre la replicación vírica de un agente infeccioso vírico.

23. Un procedimiento de producción de una proteína de interés que comprende introducir en la célula progenitora

o célula madre hepática según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, 10 o 12, o la línea celular o población celular según cualquiera de las reivindicaciones 9, 10 o 12, un gen funcional que codifique una proteína de interés, incubar la población de células hepáticas en condiciones eficaces para que tenga lugar la transcripción, traducción y opcionalmente modificación postraduccional y recoger la proteína de interés.

**(Ver fórmula)**

24. El procedimiento de la reivindicación 23, en que la proteína de interés comprende un antígeno de vacuna.

25. Una célula progenitora o célula madre hepática humana o línea celular o población celular, para uso en el tratamiento de una enfermedad hepática elegida del grupo constituido por: fenilcetonuria y otras aminoacidopatías, hemofilia y otras deficiencias de factor de coagulación, hipercolesterolemia familiar y otros trastornos del metabolismo lipídico, trastornos del ciclo de la urea, glucogenosis, galactosemia, fructosemia, tirosinemia, deficiencias del metabolismo de proteínas y carbohidratos, aciduria orgánica, enfermedades mitocondriales, trastornos peroxisómicos y lisosómicos, anormalidades de la síntesis de proteínas, defectos de transportadores de células hepáticas, defecto de glucosilación, hepatitis, cirrosis, errores congénitos del metabolismo, insuficiencia hepática aguda, infecciones hepáticas agudas, toxicidad química aguda, insuficiencia hepática crónica, insuficiencia hepática fulminante, colangitis, cirrosis biliar, síndrome de Alagille, deficiencia de α-1-antitripsina, hepatitis autoinmune, atresia biliar, cáncer de hígado, enfermedad quística del hígado, esteatosis hepática, galactosemia, cálculos biliares, síndrome de Gilbert, hemocromatosis, hepatitis A, hepatitis B, hepatitis C y otras infecciones víricas de hepatitis, porfiria, colangitis esclerosante primaria, síndrome de Reye, sarcoidosis, tirosinemia, enfermedad de almacenamiento de glucógeno de tipo 1 y enfermedad de Wilson;

(i) en el que dicha célula progenitora o célula madre hepática humana es una célula progenitora o célula madre humana aislada originada a partir de hígado adulto humano, caracterizado porque: (a) expresa al menos un marcador mesenquimal elegido de los marcadores CD90, CD73, CD44, vimentina y α-actina de músculo liso (ASMA), (b) expresa el marcador de hepatocito albúmina (ALB) y (c) es negativo para citoqueratina 19 (CK-19), o

(ii) en el que dicha línea celular o población celular es una línea celular o población celular que comprende la célula progenitora o célula madre hepática humana aislada como se define en (i).

26. Un procedimiento de realización de un ensayo de toxicidad in vitro que comprende: exponer una célula progenitora o célula madre hepática humana o línea celular o población celular a un agente de ensayo, y observar al menos un efecto, si lo hubiera, del agente de ensayo sobre la población de células hepáticas, preferiblemente en el que el al menos un efecto incluye un efecto sobre la viabilidad celular, la función celular o ambas,

(i) en el que dicha célula progenitora o célula madre hepática humana es una célula progenitora o célula madre humana aislada originada a partir de hígado adulto humano, caracterizado porque: (a) expresa al menos un marcador mesenquimal elegido de los marcadores CD90, CD73, CD44, vimentina y α-actina de músculo liso (ASMA), (b) expresa el marcador de hepatocito albúmina (ALB) y (c) es negativo para citoqueratina 19 (CK-19), o

(ii) en el que dicha línea celular o población celular es una línea celular o población celular que comprende la célula progenitora o célula madre hepática humana aislada como se define en (i).

27. Un procedimiento de realización de estudios de metabolismo de fármacos in vitro que comprende: exponer la célula progenitora o célula madre hepática humana o línea celular o población celular a un agente de ensayo, y observar al menos un cambio, si lo hubiera, que implique al agente de ensayo después de un periodo de ensayo predeterminado, preferiblemente en el que el al menos un cambio incluya un cambio en la estructura, concentración

o ambas del agente de ensayo;

(i) en el que dicha célula progenitora o célula madre hepática humana es una célula progenitora o célula madre humana aislada originada a partir de hígado adulto humano, caracterizado porque: (a) expresa al menos un marcador mesenquimal elegido de los marcadores CD90, CD73, CD44, vimentina y α-actina de músculo liso (ASMA), (b) expresa el marcador de hepatocito albúmina (ALB) y (c) es negativo para citoqueratina 19 (CK-19), o

(ii) en el que dicha línea celular o población celular es una línea celular o población celular que comprende la célula progenitora o célula madre hepática humana aislada como se define en (i).

28. Un dispositivo auxiliar hepático que comprende una carcasa que alberga una célula progenitora o célula madre hepática humana o una línea celular o población celular,

(i) en el que dicha célula progenitora o célula madre hepática humana es una célula progenitora o célula madre humana aislada originada a partir de hígado adulto humano, caracterizado porque: (a) expresa al menos un marcador mesenquimal elegido de los marcadores CD90, CD73, CD44, vimentina y α-actina de músculo liso (ASMA), (b) expresa el marcador de hepatocito albúmina (ALB) y (c) es negativo para citoqueratina 19 (CK-19), o

(ii) en el que dicha línea celular o población celular es una línea celular o población celular que comprende la célula progenitora o célula madre hepática humana aislada como se define en (i).

29. Una célula progenitora o célula madre hepática humana o línea celular o población celular, en los que se ha introducido una copia funcional de un gen, o una composición que comprende dichas células progenitoras o células madre hepáticas humanas o línea celular o población celular, opcionalmente en el que dicha composición es una composición farmacéutica que comprende adicionalmente un portador farmacéuticamente aceptable, para tratar errores de la expresión génica;

**(Ver fórmula)**

(i) en el que dicha célula progenitora o célula madre hepática humana es una célula progenitora o célula madre humana aislada originada a partir de hígado adulto humano, caracterizado porque: (a) expresa al menos un marcador mesenquimal elegido de los marcadores CD90, CD73, CD44, vimentina y α-actina de músculo liso (ASMA), (b) expresa el marcador de hepatocito albúmina (ALB) y (c) es negativo para citoqueratina 19 (CK-19), o

(ii) en el que dicha línea celular o población celular es una línea celular o población celular que comprende la célula progenitora o célula madre hepática humana aislada como se define en (i).

30. Un procedimiento de realización de ensayos de agentes eficaces para tratar infecciones hepáticas que comprende infectar con un agente infeccioso de interés una célula progenitora o célula madre hepática o una línea celular o población celular, proporcionando una población infectada, exponer la población infectada a una cantidad predeterminada de agente de ensayo y observar los efectos, si los hubiera, de la exposición sobre la población infectada;

(i) en el que dicha célula progenitora o célula madre hepática humana es una célula progenitora o célula madre hepática humana aislada originada a partir de hígado adulto humano, caracterizado porque: (a) expresa al menos un marcador mesenquimal elegido de los marcadores CD90, CD73, CD44, vimentina y α-actina de músculo liso (ASMA), (b) expresa el marcador de hepatocito albúmina (ALB) y (c) es negativo para citoqueratina 19 (CK-19), o

(ii) en el que dicha línea celular o población celular es una línea celular o población celular que comprende la célula progenitora o célula madre hepática humana aislada como se define en (i).

31. El procedimiento de la reivindicación 30, en que el agente infeccioso incluye un microorganismo, preferiblemente en el que el agente infeccioso incluye uno o más virus, bacterias, hongos o combinaciones de los mismos, más preferiblemente en el que el agente infeccioso incluye un virus de la hepatitis.

32. El procedimiento de la reivindicación 30, en que los efectos observados incluyen efectos sobre la replicación vírica de un agente infeccioso vírico.

33. Un procedimiento de producción de una proteína de interés que comprende introducir en una célula progenitora o célula madre hepática o línea celular o población celular, un gen funcional que codifica una proteína de interés, incubar la población de células hepáticas en condiciones eficaces para que tenga lugar la transcripción, traducción y opcionalmente modificación postraduccional, y recoger la proteína de interés;

(i) en el que dicha célula progenitora o célula madre hepática humana es una célula progenitora o célula madre hepática humana aislada originada a partir de hígado adulto humano, caracterizado porque: (a) expresa al menos un marcador mesenquimal elegido de los marcadores CD90, CD73, CD44, vimentina y α-actina de músculo liso (ASMA), (b) expresa el marcador de hepatocito albúmina (ALB) y (c) es negativo para citoqueratina 19 (CK-19), o

(ii) en el que dicha línea celular o población celular es una línea celular o población celular que comprende la célula progenitora o célula madre hepática humana aislada como se define en (i).

34. El procedimiento de la reivindicación 20, en que la proteína de interés comprende un antígeno de vacuna.

35. El uso de las células progenitoras o células madre hepáticas humanas según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, 10 o 12, o de la línea celular o población celular de cualquiera de las reivindicaciones 9, 10 o 12, para la diferenciación in vitro o ex vivo de dichas células en células de linaje de hepatocito, particularmente hepatocitos o células de tipo hepatocito.

36. Un procedimiento para la diferenciación de células progenitoras o células madre hepáticas humanas según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, 10 o 12, o de la línea celular o población celular de cualquiera de las reivindicaciones 9, 10 o 12, en células de linaje de hepatocito, particularmente hepatocitos o células de tipo hepatocito, que comprende exponer las células progenitoras o células madre, línea celular o población celular, a medio inductor de la diferenciación hepática.