METODOS Y CONSTRUCTOS DE DNA PARA PRODUCCION DE POLIPEPTIDOS CON RENDIMIENTO ALTO.

Una casete de expresión que comprende la secuencia de ácido nucleico siguiente enlazada operativamente:



5''Pr-(TIS)D-(IBFP1)E-(CL1)G-ORF-[CL2-ORF]L-(CL3)M-(IBFP2)Q-(SSC)R-(CL4)T-(Ft)W-(Tr)X-3''

en donde

Pr es una secuencia promotora,

TIS codifica una secuencia de iniciación de la traducción,

IBFP1 codifica una primera pareja de fusión de cuerpos de inclusión que comprende una secuencia de aminoácidos correspondiente a una cualquiera de SEQ ID NO: 1-15, o una variante de la misma, en donde al menos un aminoácido en la pareja de fusión de cuerpos de inclusión está reemplazado con otro aminoácido que es un aminoácido conservador,

CL1 codifica un primer enlazador peptídico escindible,

ORF codifica un polipéptido preseleccionado,

CL2 codifica un segundo enlazador peptídico escindible,

CL3 codifica un tercer enlazador peptídico escindible,

IBFP2 codifica una segunda pareja de fusión de cuerpos de inclusión que comprende una secuencia de aminoácidos correspondiente a una cualquiera de SEQ ID No.: 1-15, o una variante de la misma, en donde al menos un aminoácido en la pareja de fusión de cuerpos de inclusión está reemplazado con otro aminoácido que es un aminoácido conservador,

SSC es un codón de parada suprimible,

CL4 codifica un cuarto enlazador peptídico escindible,

Ft codifica un marcador de fusión, y

Tr es una secuencia terminadora de la transcripción,

en donde cada uno de D o X es independientemente 0 o un número entero de 1 a 4,

en donde R es 0 o un número entero de 1 a 2,

en donde cada uno de E, G, L, M, Q, T o W es independientemente 0 o un número entero de 1 a 20,

en donde está presente uno cualquiera o ambos de IBFP1 o IBFP2, y

en donde está presente al menos uno de CL1, CL2, CL3 o CL4, y

en donde la expresión de la casete de expresión produce una proteína que tiene una pareja de fusión de cuerpos de inclusión enlazada operativamente a un polipéptido preseleccionado y que forma un cuerpo de inclusión cuando se expresa en una célula

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US03/16643.

Solicitante: MEDTRONIC, INC..

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 710 MEDTRONIC PARKWAY,MINNEAPOLIS, MN 55432.

Inventor/es: WILLIAMS,JAMES,A, LUAN,PENG, XIA,YUANNAN, HARLEY,SCOTT.

Fecha de Publicación: .

Fecha Concesión Europea: 10 de Febrero de 2010.

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C07K14/60 QUIMICA; METALURGIA.C07 QUIMICA ORGANICA.C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02; proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 14/00 Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados. › Factor de liberación de la hormona del crecimiento (GH-RF) (Somatoliberina).
  • C07K14/605 C07K 14/00 […] › Glucagones.
  • C07K14/635 C07K 14/00 […] › Hormona paratiroidea (parathormona); Péptidos relacionados con la hormona paratiroidea.
  • C12N15/63 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Introducción de material genético extraño utilizando vectores; Vectores; Utilización de huéspedes para ello; Regulación de la expresión.

Clasificación PCT:

  • C07K1/00 C07K […] › Procedimientos generales de preparación de péptidos.
  • C12N15/00 C12N […] › Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K).
  • C12N5/00 C12N […] › Células no diferenciadas humanas, animales o vegetales, p. ej. líneas celulares; Tejidos; Su cultivo o conservación; Medios de cultivo para este fin (reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00).
  • C12P1/00 C12 […] › C12P PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN ENZIMAS PARA LA SINTESIS DE UN COMPUESTO QUIMICO DADO O DE UNA COMPOSICION DADA, O PARA LA SEPARACION DE ISOMEROS OPTICOS A PARTIR DE UNA MEZCLA RACEMICA.Preparación de compuestos o de composiciones, no prevista en los grupos C12P 3/00 - C12P 39/00, utilizando microorganismos o enzimas; Procedimientos generales de preparación de compuestos o composiciones que utilizan microorganismos o enzimas.
  • C12P19/34 C12P […] › C12P 19/00 Preparación de compuestos que contienen radicales sacárido (ácido cetoaldónico C12P 7/58). › Polinucleótidos, p. ej. ácidos nucleicos, oligorribonucleótidos.
  • C12P21/06 C12P […] › C12P 21/00 Preparación de péptidos o de proteínas (proteína monocelular C12N 1/00). › preparados por hidrólisis de un enlace peptídico, p. ej. hidrolizados.

Clasificación antigua:

  • C07K1/00 C07K […] › Procedimientos generales de preparación de péptidos.
  • C12N15/00 C12N […] › Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K).
  • C12N5/00 C12N […] › Células no diferenciadas humanas, animales o vegetales, p. ej. líneas celulares; Tejidos; Su cultivo o conservación; Medios de cultivo para este fin (reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00).
  • C12P1/00 C12P […] › Preparación de compuestos o de composiciones, no prevista en los grupos C12P 3/00 - C12P 39/00, utilizando microorganismos o enzimas; Procedimientos generales de preparación de compuestos o composiciones que utilizan microorganismos o enzimas.
  • C12P19/34 C12P 19/00 […] › Polinucleótidos, p. ej. ácidos nucleicos, oligorribonucleótidos.
  • C12P21/06 C12P 21/00 […] › preparados por hidrólisis de un enlace peptídico, p. ej. hidrolizados.

Fragmento de la descripción:

Métodos y constructos de DNA para producción de polipéptidos con rendimiento alto.

Campo de la invención

La presente invención se refiere en general al campo de la expresión de proteínas. Más específicamente, se refiere a métodos y constructos de DNA para la expresión de polipéptidos y proteínas.

Antecedentes de la invención

Los polipéptidos son útiles para el tratamiento de enfermedades en humanos y animales. Ejemplos de tales polipéptidos incluyen insulina para el tratamiento de la diabetes, interferón para el tratamiento de infecciones virales, interleuquinas para modulación del sistema inmunitario, eritropoyetina para estimulación de la formación de los glóbulos rojos de la sangre, y factores de crecimiento que actúan para mediar el crecimiento tanto prenatal como postnatal.

Muchos polipéptidos bioactivos pueden producirse por el uso de métodos de síntesis química. Sin embargo, tales métodos de producción son en muchos casos ineficientes e intensivos en mano de obra, lo que conduce a coste incrementado y disponibilidad reducida de polipéptidos terapéuticamente útiles. Una alternativa a la síntesis química es proporcionada por la tecnología recombinante, que permite la producción con alto rendimiento de polipéptidos bioactivos en microbios. Dicha producción permite que un número mayor de personas pueda ser tratado a un coste reducido.

Si bien se han hecho grandes progresos en la tecnología recombinante, la expresión de proteínas y péptidos en las células puede ser problemática. Esto puede ser debido a niveles de expresión bajos o por destrucción del polipéptido expresado por enzimas proteolíticas contenidas en las células. Esto es especialmente problemático cuando se trata de expresar proteínas y péptidos pequeños.

Estos problemas se han abordado en el pasado por la producción de proteínas de fusión que contienen el polipéptido deseado fusionado a un polipéptido portador. La expresión de un polipéptido deseado como una proteína de fusión en una célula protegerá a menudo el polipéptido deseado contra las enzimas destructivas y permitirá que la proteína de fusión se purifique con rendimientos elevados. La proteína de fusión se trata luego para escindir el polipéptido deseado del polipéptido portador y el polipéptido deseado se aísla. Muchos polipéptidos portadores se han utilizado de acuerdo con este protocolo. Ejemplos de tales polipéptidos portadores incluyen ß-galactosidasa, glutatión-S-transferasa, el término N de L-ribuloquinasa, la proteína gp55 del bacteriófago T4, y la proteína bacteriana quetosterioide-isomerasa. Si bien este protocolo presenta muchas ventajas, adolece de una eficiencia de producción reducida debido al gran tamaño de la proteína portadora. Así, el polipéptido deseado puede constituir un pequeño porcentaje de la masa total de la proteína de fusión purificada, lo que da como resultado rendimientos reducidos del polipéptido deseado.

Otro método para producir un polipéptido deseado por tecnología recombinante implica la producción de una proteína de fusión que contiene el polipéptido deseado fusionado a una secuencia de polipéptido adicional. En este caso, la secuencia del polipéptido adicional hace que la proteína de fusión forme una masa insoluble en una célula denominada cuerpo de inclusión. Estos cuerpos de inclusión se aíslan luego de la célula y la proteína de fusión se purifica. La proteína de fusión se trata después para escindir la secuencia del polipéptido adicional de la proteína de fusión y se aísla el polipéptido deseado. Este método ha proporcionado un alto nivel de expresión de polipéptidos deseados. Una ventaja de dicho método es que la secuencia polipeptídica adicional será en muchos casos más pequeña que el polipéptido deseado y por consiguiente constituirá un menor porcentaje de la proteína de fusión producida conduciendo a una eficiencia de producción incrementada. Una desventaja de tales sistemas es que los mismos producen cuerpos de inclusión cuya solubilización es muy difícil a fin de aislar un polipéptido de interés.

Williams et al. (Genes & Development, 5:2481, 1991) investigan el control del desarrollo de las alas y balancines de Drosophila por el producto del gen nuclear vestigial. Se generaron anticuerpos contra el producto del gen vestigial en conejos después de inmunización con una proteína recombinante de fusión que se produjo por clonación de fragmentos del cDNA del gen vestigial en un vector de expresión y purificación parcial de la proteína de fusión recombinante de los cuerpos de inclusión insolubles antes de inmunización.

Lee et al. (Appl. Microbiol. Biotechnol., 58:790, 2002) describen la expresión de repeticiones multímeras en tándem de buforina II como cuerpos de inclusión. El gen codificante del péptido antimicrobiano básico, buforina II, se fusionó al gen codificante del péptido acídico, MMIS. Se construyeron genes de fusión multímeros MMIS-buforina II que contenían unidades múltiples idénticas del gen de fusión MMIS-buforina II dispuestas unas tras otras. Los constructos multímeros repetidos se expresaron en E. coli, y los péptidos recombinantes se purificaron de los cuerpos de inclusión.

De acuerdo con ello, existe necesidad de secuencias polipeptídicas adicionales que puedan utilizarse para producir polipéptidos deseados mediante formación de cuerpos de inclusión. Existe también necesidad de secuencias polipeptídicas adicionales que puedan utilizarse para producir cuerpos de inclusión que tengan características que permitan que los mismos se manipulen más fácilmente durante la producción y purificación de polipéptidos deseados.

Sumario de la invención

La invención proporciona una casete de expresión para la expresión de un polipéptido en tándem que forma un cuerpo de inclusión. La invención proporciona también una casete de expresión para la expresión de un polipéptido en tándem que forma un cuerpo de inclusión que exhibe un aislamiento mejorado. Se proporciona también por la invención un RNA producido por transcripción de una casete de expresión de la invención. La invención proporciona también una proteína producida por traducción de un RNA producido por transcripción de una casete de expresión de la invención. Se proporciona también por la invención un constructo de ácido nucleico que contiene un vector y una casete de expresión de la invención. La invención proporciona también una célula que contiene una casete de expresión o un constructo de ácido nucleico de la invención. Se proporciona también por la invención un polipéptido en tándem que contiene una pareja de fusión de cuerpos de inclusión enlazada operativamente a un polipéptido preseleccionado. La invención proporciona también un método para seleccionar una pareja de fusión de cuerpos de inclusión que confiere mejora en el aislamiento a un cuerpo de inclusión.

La casete de expresión puede codificar un polipéptido en tándem que incluye un polipéptido preseleccionado que está enlazado operativamente a una pareja de fusión de cuerpos de inclusión. La casete de expresión puede codificar un polipéptido en tándem que incluye un polipéptido preseleccionado que está enlazado operativamente a una pareja de fusión de cuerpos de inclusión y un enlazador peptídico escindible. La casete de expresión puede codificar también un polipéptido en tándem que incluye un polipéptido preseleccionado que está enlazado operativamente a una pareja de fusión de cuerpos de inclusión, y un marcador de fusión. La casete de expresión puede codificar también un polipéptido en tándem que incluye un polipéptido preseleccionado que está enlazado operativamente a una pareja de fusión de cuerpos de inclusión, un péptido enlazador escindible, y un marcador de fusión. La casete de expresión puede codificar un polipéptido en tándem que tiene un polipéptido preseleccionado, una pareja de fusión de cuerpos de inclusión, un enlazador peptídico escindible, y un marcador de fusión enlazados operativamente en cualquier orden que hará que el polipéptido en tándem forme un cuerpo de inclusión.

Preferiblemente, la casete de expresión codifica un polipéptido preseleccionado que es un polipéptido bioactivo. Más preferiblemente, la casete de expresión codifica un polipéptido preseleccionado que es útil para tratar una enfermedad en un humano o animal. Aún más preferiblemente, la casete de expresión codifica un polipéptido preseleccionado que es el péptido 1 semejante a glucagón (GLP-1),...

 


Reivindicaciones:

1. Una casete de expresión que comprende la secuencia de ácido nucleico siguiente enlazada operativamente:

5'Pr-(TIS)D-(IBFP1)E-(CL1)G-ORF-[CL2-ORF]L-(CL3)M-(IBFP2)Q-(SSC)R-(CL4)T-(Ft)W-(Tr)X-3'

en donde

Pr es una secuencia promotora,

TIS codifica una secuencia de iniciación de la traducción,

IBFP1 codifica una primera pareja de fusión de cuerpos de inclusión que comprende una secuencia de aminoácidos correspondiente a una cualquiera de SEQ ID NO: 1-15, o una variante de la misma, en donde al menos un aminoácido en la pareja de fusión de cuerpos de inclusión está reemplazado con otro aminoácido que es un aminoácido conservador,

CL1 codifica un primer enlazador peptídico escindible,

ORF codifica un polipéptido preseleccionado,

CL2 codifica un segundo enlazador peptídico escindible,

CL3 codifica un tercer enlazador peptídico escindible,

IBFP2 codifica una segunda pareja de fusión de cuerpos de inclusión que comprende una secuencia de aminoácidos correspondiente a una cualquiera de SEQ ID No.: 1-15, o una variante de la misma, en donde al menos un aminoácido en la pareja de fusión de cuerpos de inclusión está reemplazado con otro aminoácido que es un aminoácido conservador,

SSC es un codón de parada suprimible,

CL4 codifica un cuarto enlazador peptídico escindible,

Ft codifica un marcador de fusión, y

Tr es una secuencia terminadora de la transcripción,

en donde cada uno de D o X es independientemente 0 o un número entero de 1 a 4,

en donde R es 0 o un número entero de 1 a 2,

en donde cada uno de E, G, L, M, Q, T o W es independientemente 0 o un número entero de 1 a 20,

en donde está presente uno cualquiera o ambos de IBFP1 o IBFP2, y

en donde está presente al menos uno de CL1, CL2, CL3 o CL4, y

en donde la expresión de la casete de expresión produce una proteína que tiene una pareja de fusión de cuerpos de inclusión enlazada operativamente a un polipéptido preseleccionado y que forma un cuerpo de inclusión cuando se expresa en una célula.

2. La casete de expresión de la reivindicación 1 que comprende adicionalmente una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia señal que está acoplada operativamente a o próxima al término amino o al término carboxilo de la proteína que tiene una pareja de fusión de cuerpos de inclusión enlazada operativamente a un polipéptido preseleccionado.

3. La casete de expresión de la reivindicación 2, en donde la secuencia señal dirige la proteína asociada operativamente que tiene una pareja de fusión de cuerpos de inclusión enlazada operativamente a un polipéptido preseleccionado a un espacio periplásmico, a una membrana interna, o a una membrana externa de la célula.

4. La casete de expresión de la reivindicación 2, en donde la secuencia señal se obtiene a partir de una proteína seleccionada del grupo constituido por la proteína mayor de la cubierta del fago fd, la proteína menor de la cubierta del fago fd, fosfatasa alcalina, proteína de fijación de maltosa, proteína de fijación específica de leucina, ß-lactamasa, lipoproteína, LamB y OmpA.

5. La casete de expresión de la reivindicación 1, en donde la secuencia de ácido nucleico de una cualquiera o ambas de IBFP1 o IBFP2 codifica una pareja de fusión de cuerpos de inclusión que modula la mejora de aislamiento de un cuerpo de inclusión formado a partir de la proteína que tiene una pareja de fusión de cuerpos de inclusión enlazada operativamente a un polipéptido preseleccionado.

6. La casete de expresión de la reivindicación 1, en donde la mejora de aislamiento del cuerpo de inclusión es auto-adhesión, solubilidad, estabilidad de purificación, resistencia a la proteólisis, o punto isoeléctrico alterado.

7. La casete de expresión de la reivindicación 1, en donde el promotor incluye un operador seleccionado del grupo constituido por un operador lac, un operador del fago lambda, un operador de ß-galactosidasa, un operador arabinosa, un operador lexA, y un operador trp.

8. La casete de expresión de la reivindicación 1, en donde el promotor es un promotor T7lac, un promotor tac, un promotor lac, un promotor del fago lambda, un promotor del choque térmico, o un promotor del virus Chlorella.

9. La casete de expresión de la reivindicación 1, en donde la secuencia de iniciación de la traducción se obtiene a partir de un gen que codifica una proteína seleccionada del grupo constituido por el gen 10 del fago T7, A del fago Qß, la cubierta del fago Qß, la replicasa del fago Qß, Cro del fago lambda, la cubierta del fago fl, A del fago fX174, B del fago fX174, E del fago f174, lipoproteína, RecA, GalE, GalT, lacI, lacZ, el ribosoma L10, el ribosoma L7/L12, y la subunidad ß de RNA-polimerasa.

10. La casete de expresión de la reivindicación 1, en donde cada uno del primer enlazador peptídico escindible, el segundo enlazador peptídico escindible, el tercer enlazador peptídico escindible, o el cuarto enlazador peptídico escindible puede ser escindido independientemente por un agente de escisión seleccionado del grupo constituido por paladio, bromuro de cianógeno, Clostripaína, Trombina, Tripsina, roteasa afín a Tripsina, Carboxipeptidasa, Enteroquinasa, proteasa Kex 2, proteasa Omp T, proteasa del Factor Xa, Subtilisina, proteasa de HIV, proteasa de Rhinovirus, proteasa de Furilisina, proteasa IgA, proteasa Pace Humana, Colagenasa, proteasa Nia del potivirus pos del Ciruelo, proteasa 2APro del Poliovirus, proteasa 3C del Poliovirus, proteasa Nia, Genenasa, Furina, Quimotripsina, Elastasa, Subtilisina, Proteinasa K, Pepsina, Rennina, proteasas aspárticas microbianas, Papaína, Ficina, Bromelaína, Colagenasa, Termolisina, Endoproteasa Arg-C, Endoproteasa Glu-C, Endoproteasa Lys-C, Calicreína y Plasmina.

11. La casete de expresión de la reivindicación 1, en donde el ORF codifica GLP-1, GLP-2, PTH, GRF, clostripaína, o una variante de las mismas.

12. La casete de expresión de la reivindicación 1, en donde el ORF contiene un codón de parada suprimible.

13. La casete de expresión de la reivindicación 1, en donde el codón de parada suprimible es un codón ámbar o un codón ocre.

14. La casete de expresión de la reivindicación 13, en donde el codón de parada suprimible crea un enlazador peptídico escindible, que es escindible por ejemplo por una proteasa específica de tejido tal como el antígeno específico de próstata.

15. La casete de expresión de la reivindicación 1, en donde el marcador de fusión es ß-gal, GST, CAT, TrpE, SPA, SPG, MBP, SBD, CBDCenA, CBDCex, dominio de fijación de biotina, recA, Flag, poli(Arg), poli(Asp), glutamina, poli(His), poli(Phe), poli(Cys), proteína fluorescente verde, proteína fluorescente roja, proteína fluorescente amarilla, proteína fluorescente cayena, biotina, avidina, estreptavidina, o un epítope de anticuerpo.

16. La casete de expresión de la reivindicación 1, en donde la secuencia de terminación es un terminador T7.

17. Un RNA producido por transcripción de la casete de expresión de la reivindicación 1.

18. Una proteína que tiene una pareja de fusión de cuerpos de inclusión enlazada operativamente a un polipéptido preseleccionado y que se produce por traducción del RNA de la reivindicación 17.

19. Un constructo de ácido nucleico que comprende un vector y la casete de expresión de la reivindicación 1.

20. El constructo de ácido nucleico de la reivindicación 19, en el cual el vector es un virus, un plásmido, un fagémido, un cromosoma artificial bacteriano, un cromosoma artificial de levadura, un bacteriófago, un factor f o un cósmido.

21. Una célula procariota como por ejemplo una bacteria tal como Escherichia coli o una célula eucariota como por ejemplo una célula de levadura, una célula de insecto o una célula de mamífero que comprende el constructo de ácido nucleico de la reivindicación 19.

22. La proteína de la reivindicación 18, en donde el polipéptido preseleccionado codificado por ORF no está asociado naturalmente con la pareja de fusión de cuerpos de inclusión codificada por IBFP1 o IBFP2.

23. Una proteína de acuerdo con la reivindicación 22, en donde la primera región está en o próxima al término N de la segunda región; o en donde la primera región está en o próxima al término C de la segunda región.

24. Una proteína de acuerdo con la reivindicación 22, en donde la secuencia de aminoácidos preseleccionada corresponde a la de GLP-1, GLP-2, PTH, GRF, clostripaína, o una variante de las mismas.

25. Una proteína de acuerdo con la reivindicación 22, que comprende adicionalmente un enlazador peptídico escindible entre la primera región y la segunda región.

26. La proteína de la reivindicación 25, en donde el enlazador peptídico escindible puede ser escindido por un agente de escisión seleccionado del grupo constituido por paladio, bromuro de cianógeno, Clostripaína, Trombina, Tripsina, proteasa afín a Tripsina, Carboxipeptidasa, Enteroquinasa, proteasa Kex 2, proteasa Omp T, proteasa del Factor Xa, Subtilisina, proteasa de HIV, proteasa de Rhinovirus, proteasa de Furilisina, proteasa IgA, proteasa Pace Humana, Colagenasa, proteasa Nia del potivirus pos del Ciruelo, proteasa 2APro del Poliovirus, proteasa 3C del Poliovirus, proteasa Nia, Genenasa, Furina, Quimotripsina, Elastasa, Subtilisina, Proteinasa K, Pepsina, Rennina, proteasas aspárticas microbianas, Papaína, Ficina, Bromelaína, Colagenasa, Termolisina, Endoproteasa Arg-C, Endoproteasa Glu-C, Endoproteasa Lys-C, Calicreína y Plasmina.

27. La proteína de acuerdo con la reivindicación 25, en donde el enlazador peptídico escindible es escindido por una proteasa específica de tejido, tal como el antígeno específico de próstata.

28. La proteína de acuerdo con la reivindicación 22, que comprende adicionalmente un marcador de fusión enlazado operativamente.

29. La proteína de acuerdo con la reivindicación 28, en donde el marcador de fusión es un ligando para un receptor celular, tal como insulina; o en donde el marcador de fusión es ß-gal, GST, CAT, TrpE, SPA, SPG, MBP, SBD, CBDCenA, CBDCex, dominio de fijación de biotina, recA, Flag, poli(Arg), poli(Asp), glutamina, poli(His), poli(Phe), poli(cys), proteína fluorescente verde, proteína fluorescente roja, proteína fluorescente amarilla, proteína fluorescente cayena, biotina, avidina, estreptavidina, o un epítope de anticuerpo.

30. Una proteína de acuerdo con la reivindicación 22, en donde la secuencia de aminoácidos preseleccionada tiene una longitud de 2 a 1000, particularmente 2 a 100, y más particularmente 2 a 10 aminoácidos.

31. Una proteína de acuerdo con la reivindicación 22, en donde al menos un aminoácido en la secuencia de aminoácidos preseleccionada está reemplazado por un análogo de aminoácido.

32. La proteína de la reivindicación 22, en donde la secuencia de aminoácidos de la pareja de fusión de cuerpos de inclusión que comprende una cualquiera de SEQ ID NO: 1-15 está alterada por reemplazamiento de al menos un aminoácido con un aminoácido seleccionado del grupo constituido por un aminoácido acídico, un aminoácido básico y un aminoácido alifático.

33. La proteína de la reivindicación 22, en donde la secuencia de aminoácidos de la pareja de fusión de cuerpos de inclusión que comprende una cualquiera de SEQ ID NO: 1-15 está alterada por reemplazamiento de al menos un aminoácido que tiene un valor pK entre 4 y 12; particularmente un valor pK entre 4 y 7, más particularmente entre 6 y 7; o particularmente un valor pK entre 7 y 12.

34. La proteína de la reivindicación 28, que comprende adicionalmente un enlazador peptídico escindible entre la secuencia de aminoácidos preseleccionada y el marcador de fusión.

35. La proteína de la reivindicación 34, en donde el enlazador peptídico escindible puede ser escindido por un agente de escisión seleccionado del grupo constituido por paladio, bromuro de cianógeno, Clostripaína, Trombina, Tripsina, proteasa afín a Tripsina, Carboxipeptidasa, Enteroquinasa, proteasa Kex 2, proteasa QmpT, proteasa del factor Xa, Subtilisina, proteasa de HIV, proteasa de Rinovirus, proteasa de Furilisina, proteasa de IgA, proteasa Pace Humana, Colagenasa, proteasa Nia del potivirus pos del Ciruelo, proteasa 2APro del Poliovirus, proteasa 3C del Poliovirus, proteasa Nia, Genenasa, Furina, Quimotripsina, Elastasa, Subtilisina, Proteinasa K, Pepsina, Rennina, proteasas aspárticas microbianas, Papaína, Ficina, Bromelaína, Colagenasa, Termolisina, Endoproteasa Arg-C, Endoproteasa Glu-C, Endoproteasa Lys-C, Calicreína y Plasmina.

36. Una proteína de la reivindicación 22, donde la primera región hace que la proteína forme un cuerpo de inclusión cuando se expresa en una célula, por ejemplo una bacteria tal como Escherichia coli, una célula de insecto, una célula de levadura, o una célula de mamífero.

37. Una secuencia de DNA que codifica la proteína de la reivindicación 22.

38. Uso de la proteína de la reivindicación 22, en donde la pareja de fusión de cuerpos de inclusión comprende una secuencia de aminoácidos correspondiente a una cualquiera de SEQ ID NO: 1-15, para selección de una secuencia de aminoácidos de una pareja de fusión de cuerpos de inclusión que confiere mejora de aislamiento a un cuerpo de inclusión que comprende:

a) alterar la secuencia de aminoácidos de la proteína de la pareja de fusión de cuerpos de inclusión que forma el cuerpo de inclusión, y

b) determinar si el cuerpo de inclusión exhibe autoadhesión mejorada, solubilidad controlable, estabilidad de purificación, o resistencia a la proteólisis.

39. El uso de la reivindicación 38, en donde la secuencia de aminoácidos de la pareja de fusión de cuerpos de inclusión que comprende una cualquiera de SEQ ID NO: 1-15 está alterada por reemplazamiento de al menos un aminoácido con un aminoácido seleccionado del grupo constituido por un aminoácido conservador, un aminoácido hidrófobo, un aminoácido hidrófilo, y un aminoácido sin carga.

40. El uso de la reivindicación 38, en donde la secuencia de aminoácidos de la pareja de fusión de cuerpos de inclusión que comprende una cualquiera de SEQ ID NO: 1-15 se altera por reemplazamiento de al menos un aminoácido que tiene un valor pK entre 4 y 12; particularmente un valor pK entre 4 y 7, más particularmente 6 y 7; o particularmente un valor pK entre 7 y 12.

41. Una pareja de fusión de cuerpos de inclusión producida por escisión de la proteína de la reivindicación 18 y que tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a una cualquiera de SEQ ID NO: 2-15.

42. Un método para producir la proteína de la reivindicación 18 que comprende:

a) expresar la proteína de la reivindicación 18 en una célula, y

b) aislar la proteína.

43.Una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende

a) SEQ ID NO: 83;

b) un enlazador peptídico escindible, y

c) una cualquiera de SEQ ID NO: 1-15.

44. Una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de aminoácidos de la reivindicación 43.

45. La casete de expresión de la reivindicación 1, en donde la al menos una IBFP1 ó 2 que está presente codifica una cualquiera de SEQ ID NO: 2-15, y variantes de la misma, en donde al menos un aminoácido en la pareja de fusión de cuerpos de inclusión está reemplazado con otro aminoácido que es un aminoácido conservador.

46. La casete de expresión de la reivindicación 1, en donde la al menos una IBFP1 ó 2 que está presente codifica una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos 70%, particularmente al menos 80%, más particularmente al menos 90% y muy particularmente al menos 98% de identidad de secuencia con una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos correspondiente a SEQ ID NO: 2-15.

47. Una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos codificada por la casete de expresión de la reivindicación 45.

48. Una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos codificada por la casete de expresión de la reivindicación 46.


 

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