a) combinar un polímero soluble en agua, terminado en amina, con un reactivo de maleimida en condiciones sustancialmente no acuosas para formar un polímero soluble en agua,

terminado en ácido maleámico, sustituido; y b) exponer el polímero soluble en agua, terminado en ácido maleámico, a condiciones de eliminación para dar como resultado de esta manera un polímero soluble en agua, terminado en maleimida, en el que el reactivo de maleimida es de fórmula: en la que: Y 1 es O o S; Y 2 es O o S; (a) es un número entero de 1 a 20; R 1 , en cada caso, es independientemente H o un radical orgánico; R 2 , en cada caso, es independientemente H o un radical orgánico; R 3 , en cada caso, es independientemente H o un radical orgánico; y R 4 , en cada caso, es independientemente H o un radical orgánico, y en la que el polímero soluble en agua, terminado en maleimida, es de la fórmula: en la que: POLI es un polímero soluble en agua; (b) es cero o uno; X 1 , cuando está presente, es un resto espaciador; R 3 , en cada caso, es independientemente H o un radical orgánico; y R 4 , en cada caso, es independientemente H o un radical orgánico

Método para preparar maleimidas poliméricas.

Campo de la invención

Esta invención se refiere a métodos para preparar polímeros solubles en agua y no peptídicos que llevan grupos funcionales maleimida, particularmente polímeros de poli(etilenglicol) terminados en maleimida, y a composiciones y formulaciones que los contienen. El alcance de protección de la patente se determina mediante las reivindicaciones 1-36 adjuntas.

Antecedentes de la invención

Las maleimidas son derivados versátiles que encuentran un uso extensivo en la síntesis química y en aplicaciones biológicas y farmacológicas. Como aceptores de Michael, las maleimidas reaccionan fácilmente con grupos sulfhidrilo para formar enlaces tioéter estables. Esta reacción se usa extensivamente con proteínas y similares donde los grupos tanto sulfhidrilo como amina están presentes. A un pH aproximadamente neutro, las maleimidas son altamente selectivas, siendo los grupos sulfhidrilo aproximadamente 1.000 veces más reactivos que los grupos amina (Smyth et al., Biochem. J., 91, 589, 1964; Gorin et al. Arch. Biochem. Biophys. 115, 593, 1966; Partis et al., J. Protein Chem, 2, 263-277, 1983). A valores de pH mayores de 8 o por encima, la reacción de las maleimidas con grupos amina empieza a competir significativamente (Brewer and Riehm, Anal. Biochem. 18, 248, 1967).

Aunque se conocen mejor como aceptores de Michael, las maleimidas son útiles también por su reactividad como dienófilos (Baldwin et al., Tetrahedron Lett., 32, 5877, 1991; Philp and Robertson, J. Chem. Soc., Chem. Commun., 1998, 879; Bravo et al., Heterocycles, 53, 81, 2000) y como dipolarófilos (Grigg et al., J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1, 1988, 2693; Konopikova et al., Collect. Czech. Chem. Commun., 57, 1521, 1991; Philp and Booth, Tetrahedron Lett, 39, 6987, 1998).

Los grupos maleimida pueden usarse para facilitar la fijación covalente de proteínas y otras moléculas a polímeros. Por ejemplo, el polímero hidrófilo "poli(etilenglicol)", abreviado como "PEG", a menudo se usa para conjugar moléculas bioactivas y hacerlas solubles en medios acuosos (Harris et al. "Poly(Ethylene Glycol) Chemistry and Biological Applications", ACS Symposium Series, ACS, Washington, DC, 1997). PEG maleimida es un ejemplo de un polímero reactivo adecuado para reaccionar con grupos tiol o amino en una molécula biológicamente activa.

Muchos de los métodos para preparar PEG maleimidas implican conectar un PEG activado a una molécula enlazadora pequeña que comprende un grupo maleimida, muchas de los cuales están disponibles en el mercado. Hay diversos inconvenientes asociados con las varias PEG maleimidas conocidas y con sus métodos de producción. Por ejemplo, la denominada PEG maleimida "sin enlazador", que no tiene un grupo enlazador entre el PEG y el grupo maleimida, a menudo se prepara directamente a partir de una PEG amina usando uno de los dos métodos. Véase la Patente de Estados Unidos Nº 6.602.498. Estos métodos, sin embargo, dan como resultado generalmente un producto relativamente impuro en tanto que una cantidad significativamente pequeña de un derivado que contiene ácido maleámico de anillo abierto está presente en el producto final como se analizará más adelante.

En el primer método descrito la Patente de Estados Unidos Nº 6.602.498, una estructura básica de polímero soluble en agua y no peptídico se hace reaccionar con anhídrido maleico para formar un intermedio de amida del ácido carboxílico de anillo abierto (un intermedio de ácido maleámico). El anillo del intermedio se cierra después en una segunda etapa calentando el intermedio en presencia de anhídrido acético y una sal de ácido acético, tal como acetato sódico o potásico, a una temperatura de aproximadamente 50ºC a aproximadamente 140ºC durante aproximadamente 0,2 a aproximadamente 5 horas. Este proceso en dos etapas se resume en el Esquema de Reacción I proporcionado a continuación:

Esquema de Reacción I

La composición que contiene polímero soluble en agua, terminado en maleimida, bruto, preparada por este método puede contener una cantidad sustancial del intermedio de ácido maleámico de anillo abierto. Una causa principal para la aparición del intermedio de ácido maleámico de anillo abierto puede estar en la etapa de calentamiento, especialmente si se genera cualquier especie ácida o es un contaminante en el anhídrido acético. En estas condiciones, es posible isomerizar el enlace C=C y, de esta manera, hacer que el cierre del anillo sea difícil, si no imposible. Como resultado, es deseable purificar el producto polimérico por algún método, tal como cromatografía de intercambio de iones, capaz de retirar la impureza. Sin embargo, el sistema de anillo de maleimida no tolera una columna cromatográfica que posea sitios básicos o nucleófilos, haciendo de esta manera que la purificación sea más difícil. Un segundo problema con esta ruta sintética radica en el uso de PEG amina.

Análogamente, Sakanoue et al., en la Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos Nº 2003/0065134 A1, describen un método relacionado excepto que las PEG maleimidas producidas allí comprenden un grupo propileno en lugar de un grupo etileno entre el oxígeno de PEG final y el nitrógeno de la maleimida. El método descrito en Sakanoue et al., sin embargo, sufre los mismos problemas mencionados anteriormente. Adicionalmente, la referencia muestra que las PEG aminas generalmente se fabrican mediante reducción de un grupo nitrilo usando hidrógeno y un catalizador de níquel que puede conducir a la introducción de procesos adicionales debido a la reacción entre el producto de amina y un intermedio de imina.

En una segunda ruta sintética descrita en la Patente de Estados Unidos Nº 6.602.498 (la "Ruta de N-alcoxicarbonilmaleimida Acuosa"), una N-alcoxicarbonilmaleimida se hace reaccionar con una amina polimérica para formar un producto polimérico soluble en agua, terminado en maleimida. Ocurre una reacción de abertura de anillo y de cierre de anillo similar a la descrita anteriormente. La reacción se realiza con un lento gradiente de temperatura en aumento en un tampón de bicarbonato sódico acuoso a un pH de aproximadamente 8,5. El grupo maleimida, sin embargo, no es estable en estas condiciones y experimenta hidrólisis a ácido maleámico. Por lo tanto, ocurren dos reacciones paralelas durante la síntesis: formación del anillo de maleimida e hidrólisis del anillo de maleimida.

Un enfoque para abordar el problema sería detener la reacción en un momento en el que se forma una cantidad máxima del producto de polímero soluble en agua, terminado en maleimida. Aunque este enfoque parece firme en teoría, es una tarea casi imposible en la práctica comercial debido a la temperatura de reacción cambiante en la que es difícil conseguir de forma reproducible el gradiente de temperatura para lotes de fabricación consecutivos. Por ejemplo, se encontró que los lotes comerciales consecutivos de ciertos polímeros solubles en agua, terminados en maleimida, tenían una pureza de maleimida del 65 al 80% y un contenido de ácido maleámico de aproximadamente el 20 al 35%. De nuevo, la cromatografía no es una opción viable debido a la sensibilidad del grupo maleimida a los grupos funcionales de la columna de intercambio de iones. Adicionalmente, incluso si fuera posible controlar de forma reproducible el gradiente de temperatura y detener la reacción en el momento apropiado, el enfoque requiere un control de cerca y un equipo adicional (por ejemplo, termopares, mantas calefactoras y similares), añadiendo de esta manera complejidad al enfoque.

Otros enfoques para preparar polímeros solubles en agua, terminados en maleimida, se describen en la Publicación de Patente Internacional WO 05/056636. En un enfoque (marcado como "Esquema de Reacción II" a continuación) un polímero que comprende un grupo saliente ("GS") y una sal de una imida (mostrada como la sal potásica de una amida tricíclica) se hacen reaccionar por sustitución nucleófila para formar un intermedio polimérico, que después va seguido de una reacción de Diels-Alder inversa para proporcionar un polímero funcionalizado con maleimida y furano.

Esquema de Reacción II

Aunque la reacción mostrada anteriormente utiliza polímeros funcionalizados relativamente...

1. Un método sintético que comprende:

a) combinar un polímero soluble en agua, terminado en amina, con un reactivo de maleimida en condiciones sustancialmente no acuosas para formar un polímero soluble en agua, terminado en ácido maleámico, sustituido; y

b) exponer el polímero soluble en agua, terminado en ácido maleámico, a condiciones de eliminación para dar como resultado de esta manera un polímero soluble en agua, terminado en maleimida, en el que el reactivo de maleimida es de fórmula:

en la que:

Y¹ es O o S;

Y² es O o S;

(a) es un número entero de 1 a 20;

R¹, en cada caso, es independientemente H o un radical orgánico;

R², en cada caso, es independientemente H o un radical orgánico;

R³, en cada caso, es independientemente H o un radical orgánico; y

R⁴, en cada caso, es independientemente H o un radical orgánico,

y en la que el polímero soluble en agua, terminado en maleimida, es de la fórmula:

en la que:

POLI es un polímero soluble en agua;

(b) es cero o uno;

X¹, cuando está presente, es un resto espaciador;

R³, en cada caso, es independientemente H o un radical orgánico; y

R⁴, en cada caso, es independientemente H o un radical orgánico.

2. El método de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente aislar el polímero soluble en agua, terminando en ácido maleámico, sustituido, antes de exponer el polímero soluble en agua, terminado en ácido maleámico, a condiciones de eliminación.

3. El método de la reivindicación 2, en el que el aislamiento del polímero soluble en agua, terminado en ácido maleámico, se realiza por precipitación para preparar un polímero soluble en agua, terminado en ácido maleámico, secado.

4. El método de la reivindicación 3, en el que la precipitación se efectúa añadiendo un exceso de un agente seleccionado entre el grupo que consiste en alcohol isopropílico, éter dietílico, MTBE, heptano, THF, hexano y mezclas de los mismos.

5. El método de la reivindicación 3, que comprende adicionalmente la etapa de disolver el polímero soluble en agua, terminado en ácido maleámico, secado, para regenerar el polímero soluble en agua, terminado en ácido maleámico.

6. El método de la reivindicación 1, realizado en un disolvente orgánico.

7. El método de la reivindicación 6, en el que el disolvente orgánico se selecciona entre el grupo que consiste en hidrocarburos alifáticos halogenados, alcoholes, hidrocarburos aromáticos, alcoholes, hidrocarburos aromáticos, hidrocarburos aromáticos halogenados, amidas, nitrilos, cetonas, acetatos, éteres, éteres cíclicos y combinaciones de los mismos.

8. El método de la reivindicación 6, en el que el disolvente orgánico se selecciona entre el grupo que consiste en diclorometano, cloroformo, acetonitrilo, tolueno, metil t-butil éter, tetrahidrofurano, octanol, acetato de etilo, carbonato de dietilo, acetona, ciclohexano y combinaciones de los mismos.

9. El método de la reivindicación 8, en el que el disolvente orgánico es diclorometano o acetonitrilo.

10. El método de la reivindicación 1, en el que la etapa de combinar un polímero soluble en agua, terminado en amina, con un reactivo de maleimida en condiciones sustancialmente no acuosas para formar un polímero soluble en agua, terminado en ácido maleámico, se realiza en presencia de un catalizador básico.

11. El método de la reivindicación 1, en el que la etapa de exponer el polímero soluble en agua, terminado en ácido maleámico, a condiciones de eliminación en el disolvente orgánico se realiza en presencia de una base.

12. El método de la reivindicación 11, en el que la base se selecciona entre el grupo que consiste en bicarbonato sódico, bicarbonato potásico, carbonato sódico o carbonato potásico.

13. El método de la reivindicación 11, en el que la etapa de exponer el polímero soluble en agua, terminado en ácido maleámico, a condiciones de eliminación se realiza a una temperatura de 10 a 60ºC.

14. El método de la reivindicación 1, en el que la etapa de exponer el polímero soluble en agua, terminado en ácido maleámico, a condiciones de eliminación se realiza en presencia de un catalizador de amina no nucleófila.

15. El método de la reivindicación 14, en el que el catalizador de amina no nucleófila se selecciona del grupo que consiste en diisopropiletilamina, trietilamina, n-metil morfolina, piridina, N,N-dimetil-4-aminopiridina), 1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno y 1,4-diazabiciclo[2.2.2]octano.

16. El método de la reivindicación 1, en el que la etapa de exponer el polímero soluble en agua, terminado en ácido maleámico, a condiciones de eliminación se realiza en presencia de un agente de secado.

17. El método de la reivindicación 16, en el que el agente de secado se selecciona entre el grupo que consiste en NaHCO₃, Na₂CO₃, CaCl₂, CaSO₄, MgSO₄, KOH, Na₂SO₄, K₂CO₃, KHCO₃, tamices moleculares y combinaciones de los mismos.

18. El método de la reivindicación 2, en el que el polímero soluble en agua, terminado en amina, es un polímero soluble en agua que lleva un grupo amina terminal, en el que el polímero soluble en agua se selecciona entre el grupo que consiste en poli(alquilenglicol), poli(alcohol olefínico), poli(vinilpirrolidona), poli(hidroxialquilmetacrilamida), poli(hidroxialquilmetacrilato), poli(sacárido), poli(ácido a-hidroxiacético), poli(ácido acrílico), poli(alcohol vinílico), polifosfaceno, polioxazolina, poli(N-acriloilmorfolina) y copolímeros o terpolímeros de los mismos.

19. El método de la reivindicación 18, en el que el polímero soluble en agua es un poli(etilenglicol).

20. El método de la reivindicación 19, en el que el poli(etilenglicol) tiene un peso molecular de aproximadamente 100 a aproximadamente 100.000 Dalton.

21. El método de la reivindicación 1, en el que el polímero soluble en agua, terminado en ácido maleámico, es de la fórmula:

en la que:

POLI es un polímero soluble en agua;

(b) es cero o uno;

X¹, cuando está presente, es un resto espaciador;

Y¹ es O o S;

Y² es O o S;

(a) es un número entero de 1 a 20;

R¹, en cada caso, es independientemente H o un radical orgánico;

R², en cada caso, es independientemente H o un radical orgánico;

R³, en cada caso, es independientemente H o un radical orgánico; y

R⁴, en cada caso, es independientemente H o un radical orgánico.

22. El método de la reivindicación 21, en el que POLI es un polímero soluble en agua, lineal.

23. El método de la reivindicación 21, en el que POLI es CH₃O-(CH₂-CH₂O)_n-CH₂CH₂ y (a) es uno y, adicionalmente, en el que (n) es de 2 a 4000.

24. El método de la reivindicación 21, en el que POLI está ramificado.

25. El método de la reivindicación 1, en el que POLI es un polímero soluble en agua, lineal.

26. El método de la reivindicación 1, en el que POLI es CH₃O-(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂-, en la que (n) es de 2 a 4000.

27. El método de la reivindicación 1, en el que POLI está ramificado.

28. El método de la reivindicación 1, en el que condiciones sustancialmente no acuosas representan un medio de reacción que tiene menos de 1000 partes por millón de agua.

29. El método de la reivindicación 28, en el que las condiciones sustancialmente no acuosas representan un medio de reacción que tiene menos de 100 partes por millón de agua.

30. El método de la reivindicación 29, en el que las condiciones sustancialmente no acuosas representan un medio de reacción que tiene menos de 60 partes por millón de agua.

31. El método de la reivindicación 1, en el que se forma una composición en la que más del 70 por ciento de la especie de polímero soluble en agua en la composición son polímeros solubles en agua terminados en maleimida.

32. El método de la reivindicación 1, en el que se forma una composición en la que más del 80 por ciento de las especies poliméricas solubles en agua en la composición son polímeros solubles en agua terminados en maleimida.

33. El método de la reivindicación 1, en el que se forma una composición en la que más del 90 por ciento de las especies poliméricas solubles en agua en la composición son polímeros solubles en agua terminados en maleimida.

34. El método de la reivindicación 1, en el que se forma una composición en la que más del 93 por ciento de las especies poliméricas solubles en agua en la composición son polímeros solubles en agua terminados en maleimida.

35. El método de la reivindicación 1, en el que se forma una composición en la que más del 86 por ciento de las especies poliméricas solubles en agua en la composición son mPEG-maleimidas.

36. El método de la reivindicación 1, en el que se forma una composición en la que más del 93 por ciento de las especies poliméricas solubles en agua en la composición son mPEG-maleimidas.