La presente invención se relaciona con el uso de la toxina adenilato ciclasa (ACT),

o una variante funcionalmente equivalente de la misma, como agente inductor de la internalización de bacterias no invasivas en células eucariotas. Gracias a la ACT, dicha bacteria no invasiva puede traslocarse a través de la membrana plasmática de una célula eucariota y transferir el ADN plasmídico a dicha célula, lo que resulta útil para liberar o introducir en el interior de la célula eucariota moléculas de interés terapéutico, por ejemplo, antígenos, desencadenado así la respuesta inmune

Método para la internalización de bacterias no invasivas en células eucariotas.

Campo de la invención

La invención se relaciona, en general, con la internalización de bacterias no invasivas en células eucariotas con fines terapéuticos y/o profilácticos; en particular, la invención se relaciona con el empleo de la toxina adenilato ciclasa (ACT) o una variante funcionalmente equivalente de la misma, como agente inductor de la internalización de bacterias no invasivas en células eucariotas.

Antecedentes de la invención

El principio de la vacunación es inducir una respuesta inmune en el hospedador, protectora y duradera, frente a un microorganismo virulento. La finalidad de las vacunas es pues prevenir y controlar futuras infecciones.

Muchas de las bacterias patógenas son capaces de escapar al sistema inmune induciendo su propia internalización en células de mamífero y replicando eficazmente en su interior. La entrada de dichas bacterias al interior celular es mediada por fagocitosis típica cuando las células son fagocitos profesionales, o por fagocitosis inducida en el caso de células no fagocíticas (células epiteliales, hepatocitos, fibroblastos y células endoteliales).

Aprovechando esta propiedad, se ha desarrollado la técnica de la bactofección como herramienta que facilita la vacunación genética. La bactofección consiste en la transferencia de ADN plasmídico a células de mamífero mediada por bacterias intracelulares. Estas bacterias se caracterizan porque para su desarrollo y replicación necesitan estar en el interior de una célula. De esta manera, el uso de bacterias intracelulares se ha convertido en un método directo de transporte de ADN que consigue la expresión de proteínas heterólogas (antígenos proteicos, toxinas o enzimas) capaces de desencadenar respuestas inmunes, tanto humorales como celulares.

La estrategia de la bactofección se basa en la susceptibilidad de transformación de las bacterias patógenas intracelulares con vectores de expresión eucarióticos. De este modo, cepas atenuadas de esas bacterias pueden transportar dichos plásmidos a las células presentadoras de antígeno (APC). Una vez internalizadas, la bacterias alteran las características del compartimento fagosómico previniendo la fusión con lisosomas y garantizando así su supervivencia. También se ha descrito la capacidad, en muchas de ellas, de lisar el fagosoma y replicar en el citosol. Experimentos con Listeria monocytogenes han demostrado que el ADN plasmídico se transporta al citosol celular, tras una autodestrucción parcial de la bacteria. Una vez en el citosol, el ADN puede ser transportado al núcleo celular y, de esta manera, los antígenos codificados por el plásmido se expresan en la célula presentadora de antígeno.

Aunque se desconoce el mecanismo de transporte del ADN plasmídico desde el fagolisosoma al núcleo celular, se ha demostrado que estas cepas atenuadas pueden utilizarse como portadoras de vacunas no solo a roedores, sino también a células de primates y a células dendríticas humanas.

Uno de los principales atractivos de estos vectores bacterianos es su potencial para ser administrados oralmente, además de permitir la inducción de respuesta inmune en la mucosa, esencial en aquellas enfermedades producidas por patógenos cuya vía de entrada al organismo son las mucosas.

Otro mecanismo de vacunación alternativo empleado en los últimos años se basa en los sistemas bacterianos presentadores de antígenos recombinantes. En estos modelos, los antígenos heterólogos sintetizados por las bacterias son solamente accesibles tras la desintegración de la bacteria. Se han desarrollado alternativas para la exportación de los antígenos al citoplasma entre los que se incluyen la utilización de las señales de exportación de MalE y OmpA, o la fusión con la toxina LT-B de Escherichia coli. También se han descrito dos sistemas de secreción de antígenos heterólogos por bacterias Gram negativas, que incluyen el sistema de secreción de tipo III, que permite la "inyección" del antígeno a la célula diana y el sistema autotransportador AIDA. Sin embargo, muchos de esos sistemas solo pueden portar péptidos pequeños de los antígenos heterólogos. Para solucionar el problema del tamaño del antígeno se empieza a utilizar el sistema de secreción de hemólisina (HlyA) ya que parece no imponer ninguna limitación en el tamaño de los antígenos transportados. Este transportador permite la secreción activa de grandes antígenos heterólogos por bacterias atenuadas, lo que ha conducido al desarrollo de gran cantidad de vacunas vivas recombinantes. Muchas proteínas heterólogas presentadas mediante esta vía inducen respuestas inmunes humorales y/o celulares al organismo hospedador. Esas respuestas inmunes demuestran que existe una expresión y secreción activa de los antígenos heterólogos in vivo.

Los transportadores bacterianos pueden colonizar la superficie celular, el fagosoma especializado de las células presentadoras de antígeno (APC) o el citosol de las células infectadas y transportar un mismo antígeno a diferentes compartimientos de las APC, desencadenando así diferentes respuestas inmunes frente a un mismo antígeno.

A la vista de lo anterior, existe la necesidad de proporcionar un mecanismo alternativo a la utilización de cepas patógenas atenuadas en estas vacunas de vectores bacterianos debido al riesgo que plantean al estar formadas por microorganismos vivos. De hecho, uno de los principales escollos de estas vacunas es la posible reversión hacia la patogenicidad o que estos microorganismos mantengan su actividad patógena. A pesar del alto grado de atenuación que se consigue en este tipo de bacterias, su aplicación puede verse comprometida en pacientes con inmunodeficiencias primarias o secundarias o bien que tengan un estado de inmunosupresión provocado por fármacos o enfermedades oportunistas, así como en mujeres embarazadas.

La toxina adenilato ciclasa (ACT) es una proteína con capacidad para internalizarse al citoplasma de las células eucariotas, y, tras su activación por calmodulina, catalizar la transformación incontrolada de adenosin-trifosfato (ATP) a adenosin-monofosfato cíclico (AMPc) produciendo la intoxicación de dicha célula eucariota. Dicha ACT es un ejemplo único de toxina enzimáticamente activa capaz de translocar directamente a través de la membrana plasmática de una célula, sin que sea necesaria una endocitosis mediada por receptor. El mecanismo molecular por el que tiene lugar la translocación del dominio catalítico al citoplasma de las células es, actualmente, desconocido. Se sabe que en algunos tipos celulares es necesario un potencial de membrana negativo, aunque la toxina puede invadir de forma eficiente células con bajo potencial de membrana, como el caso de los eritrocitos, que además carecen de tráfico intracelular de membranas. En este caso, se cree que la penetración al interior del eritrocito se inicia con una adsorción inespecífica de la toxina sobre la superficie de la célula, seguida de una inserción y translocación directa del segmento de 40 kDa a través de la membrana, aunque se desconocen los eventos moleculares que tienen lugar en el proceso. La adenilato ciclasa es, al igual que la a-hemolisina de E. coli, una toxina con amplia especificidad celular. Recientemente se ha descrito que la integrina a_Mß2 (CD11b/CD18) constituye el receptor específico para la ACT en leucocitos, así como el posible empleo de dicha ACT en el reparto de epítopos de células T hacia las rutas de presentación del complejo mayor de histocompatibilidad de clase I o de clase II.

Compendio de la invención

Ahora se ha encontrado, sorprendentemente, que cuando la toxina adenilato ciclasa (ACT) está unida a la membrana externa de una bacteria no invasiva, dicha bacteria puede internalizarse e invadir una célula eucariota.

Por tanto, en un aspecto, la invención se relaciona con el uso de la ACT, o una variante funcionalmente equivalente de la misma, como agente inductor de la internalización de bacterias no invasivas en células eucariotas.

En otro aspecto, la invención se relaciona con una bacteria no invasiva que comprende, unida a su membrana, ACT o una variante funcionalmente equivalente de la misma. En una realización particular, dicha bacteria comprende además

1. Uso de la toxina adenilato ciclasa, o una variante funcionalmente equivalente de la misma, como agente inductor de la internalización de bacterias no invasivas en células eucariotas.

2. Uso según la reivindicación 1, en la que la toxina adenilato ciclasa presenta la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1.

3. Uso según la reivindicación 1 ó 2, en la que la tóxina adenilato ciclasa procede de un microorganismo del género Bordetella sp.

4. Uso según la reivindicación 3, en la que el microorganismo del género Bordetella sp. es B. pertussis, B. parapertussis o B. bronchiseptica.

5. Una bacteria no invasiva que comprende, unida a su membrana, una toxina adenilato ciclasa o una variante funcionalmente equivalente de la misma.

6. Bacteria según la reivindicación 5, que comprende además

7. Bacteria según la reivindicación 5 ó 6, en la que la toxina adenilato ciclasa presenta la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1.

8. Bacteria según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, en la que la tóxina adenilato ciclasa procede de un microorganismo del género Bordetella sp.

9. Bacteria según la reivindicación 8, en la que el microorganismo del género Bordetella sp. es B. pertussis, B. bronchiseptica o B. parapertussis.

10. Una composición farmacéutica que comprende una bacteria según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

11. Una bacteria según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9 para su uso como medicamento.

12. Uso de una bacteria según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9 en la elaboración de una vacuna.

13. Uso según la reivindicación 12, en la elaboración de una vacuna para un proceso de inmunización mediante bactofección.

14. Uso según la reivindicación 12, en la elaboración de una vacuna para un proceso de inmunización mediante un sistema bacteriano presentador de antígenos.

15. Un procedimiento para la obtención de una bacteria según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9 que comprende incubar una bacteria no invasiva con una toxina adenilato ciclasa o una variante funcionalmente equivalente de la misma.

16. Un procedimiento para la obtención de una bacteria según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9, que comprende transformar una bacteria no invasiva con un polinucleótido que codifica la toxina adenilato ciclasa o una variante funcionalmente equivalente de la misma.

17. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 15 y 16, en la que la toxina adenilato ciclasa presenta la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1.

18. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, en donde la toxina adenilato ciclasa comprende la señal de exportación para la maquinaria específica de secreción de dicha toxina.

19. Método para inducir la internalización de bacterias no invasivas en células eucariotas que comprende:

20. Método según la reivindicación 19, en la que la toxina adenilato ciclasa presenta la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1.

21. Método según la reivindicación 19 ó 20, en la que la bacteria comprende

22. Método según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21, en la que la toxina adenilato ciclasa procede de un microorganismo del género Bordetella sp.

23. Método según la reivindicación 22, en la que el microorganismo del género Bordetella sp. es B. pertussis, B. bronchiseptica o B. parapertussis.