Un método para la conservación de un microorganismo capaz de producción microbiana de un ácido graso poliinsaturado o un compuesto que comprende un ácido graso poliinsaturado como un ácido graso constituyente,

método que comprende:

(a)formar esporas de dicho microorganismo, con crecimiento hifal, en un medio formador de esporas a pH 4-7 que contiene una fuente de nutrientes que comprende una sal inorgánica y un sacárido;

(b)suspender las esporas obtenidas en (a) en agua esterilizada, o agua esterilizada que contiene un tensioactivo y/o una sal inorgánica, para preparar una suspensión de esporas, y añadir un crioprotector al 5-15% para preparar una suspensión de esporas que se crioconserva; y

(c)conservar la suspensión de esporas que se crioconserva obtenida en (b) a entre -100ºC y -20ºC

Método de producción de ácidos grasos poliinsaturados usando una nueva técnica de conservación de células.

Campo técnico

La presente invención se refiere a métodos para la conservación de microorganismos que producen ácidos grasos poliinsaturados o compuestos que los comprenden como ácidos grasos constituyentes. La correspondiente biomasa microbiana es útil para la producción de aceites crudos y/o fosfolípidos crudos obtenidos mediante extracción de la biomasa, y grasas y aceites refinados y/o fosfolípidos refinados obtenidos mediante refinado de los aceites crudos y/o fosfolípidos crudos, así como alimentos y bebidas, suplementos nutricionales terapéuticos, piensos para animales y productos farmacéuticos que incorporan la biomasa y grasas o aceites (aceites crudos y/o aceites refinados) y/o fosfolípidos (fosfolípidos crudos y/o fosfolípidos refinados).

Antecedentes

La biosíntesis de ácidos grasos poliinsaturados (abreviados posteriormente en la presente memoria como "PUFA") en seres humanos se presenta para dos series representativas, las series ?3 y ?6 (donde ? representa el número del átomo de carbono que tiene el primer doble enlace, contando desde el extremo del grupo metilo del ácido graso), y, en el caso de los ácidos grasos ?6, por ejemplo, el ácido linoleico (18:2 ?6) se convierte en ácido ?-linolénico (18:3 ?6), ácido dihomo-?-linolénico (20:3 ?6), ácido araquidónico (20:4 ?6) y ácido 4,7,10,13,16-docosapentaenoico (22:5 ?6), mediante desaturación y elongación repetidas de la cadena carbonada.

De forma similar, en el caso de los ácidos grasos ?3, el ácido a-linolénico (18:3 ?3) se convierte en ácido eicosapentaenoico (20:5 ?3), ácido 7,10,13,16,19-docosapentaenoico (22:5 ?3) y ácido 4,7,10,13,16,19-docosapentaenoico (22:6 ?3), mediante desaturación y alargamiento repetidos de la cadena carbonada. Los PUFA ?3 ácido eicosapentaenoico (posteriormente en la presente memoria, "EPA") y ácido docosapentaenoico (posteriormente en la presente memoria, "DHA") en particular son conocidos por tener numerosas funciones fisiológicas, incluyendo efectos profilácticos contra enfermedades del adulto tales como aterosclerosis y trombosis o efectos anticancerosos, así como efectos de refuerzo del aprendizaje, y se han hecho diversos intentos de utilizarlos en productos farmacéuticos y alimentos sanitarios específicos. Sin embargo, las funciones fisiológicas de PUFA distintos de los tipos ?3 (tales como ?6 y ?9) recientemente han sido objeto de atención.

El ácido araquidónico constituye aproximadamente 10% de los componentes de ácido graso de órganos vitales tales como la sangre y el hígado (por ejemplo, la relación de composiciones de los fosfolípidos en la sangre humana es 11% de ácido araquidónico, 1% de ácido eicosapentaenoico, 3% de ácido docosapentaenoico), y, como un componente estructural principal de las membranas celulares, contribuye a modular la fluidez de la membrana y realiza diversas funciones metabólicas en el cuerpo, mientras que también representa un papel importante como un precursor directo de prostaglandinas. Recientemente, se han apreciado los papeles del ácido araquidónico como un nutriente para niños lactantes y como un ácido graso constituyente de cannabinoides endógenos que exhiben efectos neurérgicos (2-araquidonoilmonoglicerol y anandamida). Normalmente, la ingestión de alimentos ricos en ácido linoleico conduce a su conversión en ácido araquidónico, pero, puesto que las funciones de las enzimas implicadas en su biosíntesis se reducen en pacientes con enfermedades del adulto o afecciones preliminares así como en niños y ancianos, tales individuos tienden a ser deficientes en ácido araquidónico; por lo tanto, es deseable proporcionar medios para su ingestión directa en forma de un ácido graso constituyente de grasas o aceites (triglicéridos).

Aunque los aceites de pescado son fuentes abundantes de PUFA ?3 tales como EPA y DHA, PUFA ?6 tales como ácido ?-linolénico, ácido dihomo-?-linolénico, ácido araquidónico y ácido 4,7,10,13,16-docosapentaenoico (22:5 ?6) virtualmente no pueden obtenerse a partir de fuentes tradicionales de grasa o aceite y, por lo tanto, las grasas y los aceites que comprenden PUFA como ácidos grasos (posteriormente en la presente memoria denominados "grasas y aceites que contienen PUFA") constituyentes obtenidos mediante fermentación de microorganismos son los más usados en la actualidad. Por ejemplo, se han propuesto métodos para obtener grasas y aceites que comprenden ácido araquidónico como un ácido graso constituyente (posteriormente en la presente memoria denominados "grasas y aceites que contienen ácido araquidónico") mediante el cultivo de diversos microorganismos capaces de producir grasas y aceites que contienen ácido araquidónico.

Se sabe que las grasas y los aceites que tienen una alta proporción de ácido araquidónico que constituye la porción de ácido graso (posteriormente en la presente memoria denominados "grasas y aceites ricos en ácido araquidónico") pueden obtenerse al usar microorganismos pertenecientes al género Mortierella (Publicación de Patente Japonesa No Examinada SHO Nº 63-44891, Publicación de Patente Japonesa No Examinada SHO Nº 63-12290). En los últimos años, uno de los usos esenciales del ácido araquidónico es en el campo de la nutrición de niños lactantes, por ejemplo, y específicamente, se ha introducido el uso de grasas y aceites que contienen ácido araquidónico obtenidos mediante fermentación en leche modificada. También se han demostrado nuevos efectos de grasas y aceites que contienen ácido araquidónico (Publicación de Patente Japonesa No Examinada Nº 2003-48831: Composition with prophylactic or ameliorative effect on symptoms and conditions associated with brain function impairment), y se espera que estos tengan gran demanda en el futuro.

Las grasas y los aceites obtenidos mediante el cultivo de microorganismos de Mortierella consisten principalmente en triglicéridos (aproximadamente 70% o más) y fosfolípidos. Las grasas y los aceites comestibles están en forma de triglicéridos y, para el propósito del uso descrito anteriormente, las grasas y los aceites originales producidos por las células (grasas y aceites obtenidos mediante extracción de las células, conocidos como "aceites crudos") se extraen de la biomasa celular producida mediante el cultivo de los microorganismos, y a continuación los aceites crudos se someten a pasos de refinado de grasas/aceites comestibles (desgomado, desoxidación, desodorización, decoloración) para obtener grasas y aceites refinados menos los fosfolípidos.

Puesto que las grasas y los aceites que contienen PUFA obtenidos mediante el cultivo de microorganismos de Mortierella se acumulan en las hifas, el cultivo debe llevarse a cabo hasta una concentración superior para incrementar el rendimiento de las grasas y los aceites que contienen PUFA por cultivo, para una economía incrementada de la producción de grasas/aceites. El rendimiento de grasas y aceites que contienen PUFA por cultivo es el producto de la concentración de células y el contenido de grasas/aceites que contienen PUFA por célula, y por lo tanto es necesario incrementar tanto la concentración de células como el contenido de grasas/aceites que contienen PUFA por célula. La concentración de células puede incrementarse al elevar la concentración de la fuente de nitrógeno del medio, que normalmente se convierte en componentes celulares.

El contenido de grasas/aceites que contienen PUFA por célula sólo puede incrementarse al controlar satisfactoriamente la morfología celular y al llevar a cabo el cultivo con un suministro de oxígeno adecuado. Métodos presentados para controlar la morfología celular incluyen la optimización de la composición del medio salino (Nueva Publicación Doméstica Japonesa Nº 98/029558), mientras que métodos para suministrar oxígeno incluyen métodos de cultivo presurizados y métodos de cultivo aeróbicos enriquecidos en oxígeno (Publicación de Patente Japonesa No Examinada HEI Nº 06-153970). Sin embargo, puesto que estos métodos se ven afectados por ligeras diferencias en las condiciones de cultivo, no es fácil asegurar la reproducibilidad del cultivo y, como resultado, no ha sido posible alcanzar una capacidad de producción estable.

Documento de patente 1: Publicación de Patente Japonesa No Examinada SHO Nº 63-44891.

Documento de patente 2: Publicación de Patente Japonesa No Examinada SHO Nº 63-12290.

Documento de patente 3: Publicación de Patente Japonesa No Examinada Nº 2003-48831.

Documento de...

1. Un método para la conservación de un microorganismo capaz de producción microbiana de un ácido graso poliinsaturado o un compuesto que comprende un ácido graso poliinsaturado como un ácido graso constituyente, método que comprende:

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha sal inorgánica es al menos un tipo de sal inorgánica seleccionado del grupo que consiste en nitrato sódico, hidrogenofosfato dipotásico, sulfato magnésico, cloruro potásico y sulfato de hierro (I).

3. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque dicho medio formador de esporas es un medio de agar de Czapek o un medio de agar de Czapek-Dox ajustado hasta un pH de 4-7.

4. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque dicho crioprotector es glicerina.

5. Un método para la conservación de un microorganismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque dicho ácido graso poliinsaturado o compuesto que comprende un ácido graso poliinsaturado como un ácido graso constituyente es un triglicérido que comprende un ácido graso poliinsaturado como un ácido graso constituyente o un fosfolípido que comprende un ácido graso poliinsaturado como un ácido graso constituyente.

6. Un método para la conservación de un microorganismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque dicho ácido graso poliinsaturado es un ácido graso insaturado ?6, un ácido graso poliinsaturado ?3 o un ácido graso poliinsaturado ?9, o una de sus combinaciones.

7. Un método para la conservación de un microorganismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque dicho ácido graso insaturado ?6 es ácido 9,12-octadecadienoico (ácido linoleico) 18:2?6, ácido 6,9,12-octadecatrienoico (ácido ?-linolénico) 18:3?6, ácido 8,11,14-eicosatrienoico (ácido dihomo-?-linolénico) 20:3?6, ácido 5,8,11,14-eicosatetraenoico (ácido araquidónico) 20:4?6, ácido 7,10,13,16-docosatetraenoico 22:9?6 o ácido 4,7,10,13,16-docosapentaenoico 22:5?6.

8. Un método para la conservación de un microorganismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque dicho ácido graso insaturado ?3 es ácido 9,12,15-octadecatrienoico (ácido a-linolénico) 18:3?3, ácido 6,9,12,15-octadecatetraenoico (ácido estearidónico) 18:4?3, ácido 11,14,17-eicosatrienoico (ácido dihomo-a-linolénico) 20:3?3, ácido 8,11,14,17-eicosatetraenoico 20:4?3, ácido 5,8,11,14,17-eicosapentaenoico 20:5?3, ácido 7,10,13,16,19-docosapentaenoico 22:5?3 o ácido 4,7,10,13,16,19-docosahexaenoico 22:6?3.

9. Un método para la conservación de un microorganismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque dicho ácido graso insaturado ?9 es ácido 6,9-octadecadienoico 18:2?9, ácido 8,11-eicosadienoico 20:2?9 o ácido 5,8,11-eicosatrienoico (ácido de Mead) 20:3?9.

10. Un método para la conservación de un microorganismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque dicho microorganismo es uno perteneciente al género Mortierella.

11. Un método para la conservación de un microorganismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque dicho microorganismo perteneciente al género Mortierella es Mortierella alpina.

12. Un método para la producción de un ácido graso poliinsaturado o un compuesto que comprende un ácido graso poliinsaturado como un ácido graso constituyente, que comprende conservar un microorganismo mediante un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 para dar esporas crioconservadas, y obtener un ácido graso poliinsaturado o un compuesto que comprende un ácido graso poliinsaturado como un ácido graso constituyente a partir de un microorganismo cultivado a partir de las esporas crioconservadas.

13. Un método de acuerdo con la reivindicación 12, que comprende descongelar las esporas crioconservadas durante 30 minutos o menos a una temperatura no superior a 40ºC.