Un método para producir un péptido, polipéptido o proteína heterólogo en una bacteria de ácido láctico,

comprendiendo el método las etapas de

(i) construir una bacteria recombinante de ácido láctico que comprende una secuencia nucleotídica que codifica el péptido, polipéptido o proteína heterólogo, y, operablemente enlazadas a ella, secuencias nucleotídicas reguladoras apropiadas, para controlar la expresión de la secuencia codificante,

(ii) cultivar dicha bacteria recombinante en condiciones de cultivo discontinuo alimentado o de cultivo continuo, para expresar el gen, y

(iii) cosechar la bacteria recombinante o el péptido, polipéptido o proteína

Método de fermentación para la producción de productos génicos heterólogos en bacterias de ácido láctico.

Campo de la invención

La presente invención se refiere en su aspecto más amplio al campo de la producción de células bacterianas, péptidos, polipéptidos o proteínas recombinantes usando tecnología de ADN recombinante, y en particular al uso de sistemas de expresión génica en una célula hospedante bacteriana de ácido láctico. Específicamente, la invención proporciona un procedimiento de fermentación discontinua alimentada (fed-batch) o continua que usa tales sistemas de expresión génica que permiten la producción eficaz en bacterias de ácido láctico de péptidos, polipéptidos o proteínas heterólogos, incluyendo enzimas y productos farmacéuticamente activos.

Técnica anterior y Antecedentes técnicos

A fin de seleccionar un sistema adecuado para la sobreexpresión de un producto génico deseado, hay que tener en cuenta un número de consideraciones. Aspectos importantes incluyen el rendimiento del producto génico heterólogo requerido, los costes de usar el sistema de expresión, y la autenticidad/actividad biológica del producto génico recombinante producido en el hospedante de producción.

Puesto que la producción a alto nivel de péptidos, polipéptidos o proteínas heterólogos será una carga para la célula hospedante, puede ser ventajoso usar un sistema de expresión génico inducible, es decir, regulable, que se pueda reprimir durante la propagación del organismo de producción, tanto para evitar períodos prolongados de cultivo como para minimizar el riesgo de seleccionar variantes no productivas.

Para desarrollar un sistema de expresión inducible, que sea adecuado para la producción a escala industrial, también es importante que la inducción del sistema no implique dificultades técnicas o el uso de sustancias costosas o tóxicas. Además de la cantidad de producto obtenido a partir del organismo de producción, la pureza del producto génico producido es muy importante. Un rendimiento elevado de producto contenido en un lisado de célula completa se puede reducir sustancialmente durante las etapas subsiguientes del procesamiento aguas abajo requeridas para eliminar componentes indeseados de la célula hospedante. Por lo tanto, generalmente se prefiere la secreción al periplasma en bacterias gramnegativas, o al medio extracelular de bacterias grampositivas.

Hasta ahora Escherichia coli y Bacillus subtilis han sido los organismos hospedantes bacterianos más ampliamente usados para la producción recombinante de péptidos, polipéptidos y proteínas. La biología molecular de estos organismos está caracterizada hasta un nivel que excede el de todos los otros microorganismos procariotas, y esta intensa investigación ha formado la base para generar una gran colección de herramientas genéticas que han permitido la clonación y expresión fáciles de genes heterólogos en estas bacterias.

Sin embargo, durante la última década se ha puesto atención creciente en el desarrollo de bacterias de ácido láctico (LAB), y en particular Lactococcus lactis, como factorías celulares para la producción de péptidos, polipéptidos y proteínas homólogos o heterólogos. Las LAB son ventajosas para la producción de productos génicos heterólogos en varios aspectos. La producción y administración de péptidos, polipéptidos y proteínas recombinantes para aplicaciones farmacéuticas están sometidas a estrictas exigencias a nivel mundial por las autoridades reguladoras. Por ejemplo, las endotoxinas, un componente de la pared celular en la mayoría de las bacterias gramnegativas, deberían de estar ausentes en el producto final. Las bacterias de ácido láctico no producen endotoxinas, lo que las hacen organismos hospedantes atractivos para la producción de proteínas. Además, varias cepas bacterianas de ácido láctico, incluyendo las cepas de L. lactis, no producen proteasas extracelulares, y son capaces de segregar péptidos, polipéptidos o proteínas, asegurando una elevada estabilidad del producto génico, facilitando su purificación subsiguiente.

El diseño de un número de sistemas de expresión génica inducibles prometedores, para uso en bacterias de ácido láctico (Kok, 1996; Kuipers et al., 1997; Djordjevic y Klaenhammer, 1998), se ha logrado a través de estudios que se centran en la regulación de la expresión génica en L. lactis y sus fagos. Los sistemas de expresión bacteriana de ácido láctico útiles incluyen el sistema NICE (de Ruyter et al., 1996), que se basa en elementos genéticos de un sistema de dos componentes que controla la biosíntesis del péptido antimicrobiano nisina en L. lactis. Otros dos sistemas de expresión inducibles útiles se basan en elementos genéticos de los bacteriófagos de L. lactis f31 (O'Sullivan et al., 1996; Walker y Klaenhammer, 1998) y r1t (Nauta et al., 1997).

Se han usado genes informadores sin promotor en transposones, vectores de integración o plásmidos (van der Vossen et al., 1987; Israelsen y Hansen, 1993; Sanders et al., 1998) para identificar promotores inducibles en LAB. Estos promotores se inducen mediante cambios en el medio, tal como el pH (Israelsen et al., 1995) y la concentración de sal (Sanders et al., 1998).

Los sistemas de expresión génica inducidos mediante metabolitos producidos por la célula hospedante o por condiciones de origen natural durante el crecimiento de la célula hospedante son de interés industrial debido al bajo coste y al estado de grado alimentario del factor inductor. Por lo tanto, se han aprovechado promotores inducibles, incluyendo el P170 inducible por pH y sus derivados como se describen en las Solicitudes de Patentes Internacionales Publicadas WO 94/16086 y WO 98/10079, cedidas junto con la presente, en el desarrollo de un nuevo sistema de expresión génico para uso en L. lactis. La transcripción desde el promotor P170 es inducida mediante pH bajo durante la transición concomitante a la fase estacionaria, es decir, la expresión es reprimida durante la fase de crecimiento exponencial. En un estudio reciente, el promotor P170 se caracterizó con detalle, y el nivel de expresión original se incrementó aproximadamente 150-200 veces mediante ingeniería genética, sin afectar a la regulación (Madsen et al., 1999).

Aunque los intentos para lograr niveles costosamente eficaces de producto génico usando células hospedantes bacterianas de ácido láctico han sido prometedores, existe sin embargo una necesidad industrial continua de incrementar la productividad de tales sistemas de producción. Adicionalmente, existe la necesidad de proporcionar procesos de fermentación en los que el medio no contenga componentes potencialmente peligrosos que puedan ser un riesgo sanitario para el usuario final de los productos. Los ejemplos de tales componentes indeseados incluyen virus animales y priones, cuya presencia no se puede excluir completamente en medios de fermentación convencionales que contienen componentes de origen animal tales como componentes nitrogenados. Sin embargo, los medios de fermentación actualmente más usados son medios químicamente indefinidos que contienen tales componentes de origen animal.

Por lo tanto, existe una fuerte demanda para proporcionar métodos para producir péptidos, polipéptidos o proteínas heterólogos, métodos los cuales son absolutamente seguros y permiten que se proporcionen los productos génicos deseados a los mismos rendimientos y preferiblemente mayores que los de los métodos de producción actuales.

Los métodos actuales para producir productos génicos heterólogos usando células hospedantes bacterianas de ácido láctico se basan en el cultivo discontinuo de las células hospedantes en medios químicamente indefinidos, ricos en nutrientes. La presente invención engloba el uso de un medio químicamente definido, es decir, sintético, en tales procedimientos de producción. Se encontró que el uso de tales medios en un procedimiento discontinuo convencional dio como resultado un rendimiento de producto génico que fue significativamente menor que el logrado en un medio convencional rico en nutrientes y químicamente indefinido. Sin embargo, se encontró que este problema se podría resolver llevando a cabo el procedimiento de producción como un procedimiento continuo o un procedimiento discontinuo alimentado.

Sumario de la invención

En consecuencia, la presente invención proporciona en su aspecto más amplio un método para producir un péptido,...

1. Un método para producir un péptido, polipéptido o proteína heterólogo en una bacteria de ácido láctico, comprendiendo el método las etapas de

2. Un método según la reivindicación 1, en el que la célula recombinante comprende un promotor constitutivo enlazado operablemente a la secuencia codificante.

3. Un método según la reivindicación 1, en el que la célula recombinante comprende un promotor regulable enlazado operablemente a la secuencia codificante.

4. Un método según la reivindicación 3, en el que el promotor regulable es regulado por un factor seleccionado del grupo que consiste en pH, la temperatura de crecimiento, el contenido de oxígeno, un desplazamiento de temperaturas que provoca la expresión de un gen de choque térmico, la composición del medio de crecimiento, incluyendo la fuerza iónica y el contenido de NaCl, la presencia/ausencia de un constituyente celular esencial o sus precursores, la acumulación de un metabolito intracelularmente o en el medio, la fase de crecimiento de la bacteria de ácido láctico y la velocidad de crecimiento de la bacteria de ácido láctico.

5. Un método según la reivindicación 3 ó 4, en el que el promotor regulable deriva de una bacteria de ácido láctico.

6. Un método según la reivindicación 5, en el que el promotor regulable es el promotor P170 regulable por pH, o un derivado del mismo que es regulable por pH.

7. Un método según la reivindicación 1 ó 2, en el que el promotor se introduce en la bacteria de ácido láctico en un replicón que se replica autónomamente.

8. Un método según la reivindicación 1 ó 2, en el que el promotor es un promotor no asociado naturalmente con la secuencia nucleotídica que codifica el péptido, polipéptido o proteína heterólogo.

9. Un método según la reivindicación 1, en el que el péptido, polipéptido o proteína heterólogo se selecciona del grupo que consiste en una enzima y un compuesto farmacéutico activo.

10. Un método según la reivindicación 1, en el que la secuencia nucleotídica codificante está enlazada operablemente a una secuencia nucleotídica que codifica un péptido señal (SP).

11. Un método según la reivindicación 10, en el que el péptido señal se selecciona del grupo que consiste en el péptido señal Usp45 y el péptido señal que tiene la secuencia MKFNKKRVAIATFIALIFVSFFTISSQDAQAAERS (SEQ ID NO: 1).

12. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en el que la bacteria de ácido láctico se cultiva en un medio químicamente definido.

13. Un método según la reivindicación 12, en el que la concentración de glucosa se mantiene a una concentración preseleccionada de al menos alrededor de 0,5 g/l mediante alimentación controlada de glucosa.

14. Un método según la reivindicación 13, en el que el control de la alimentación de glucosa al medio está enlazado al control del pH.

15. Un método según la reivindicación 12, en el que el medio químicamente definido se suplementa con extracto de levadura.

16. Un método según la reivindicación 15, en el que la cantidad de extracto de levadura está en el intervalo de 0,1-10 g/l.

17. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1-16, en el que el rendimiento de péptido, polipéptido o proteína heterólogo es al menos 5 mg/l.

18. Un método según la reivindicación 17, en el que el rendimiento de péptido, polipéptido o proteína heterólogo es al menos 100 mg/l.

19. Un método según la reivindicación 18, en el que el rendimiento de péptido, polipéptido o proteína heterólogo es al menos 200 mg/l.

20. El método de la reivindicación 1, que usa un medio basal químicamente definido (medio LM1) para cultivar bacterias, consistiendo el medio en:

21. Uso de un medio como se define en la reivindicación 20, en un procedimiento de cultivo discontinuo alimentado o continuo que usa bacterias de ácido láctico.

22. El método de la reivindicación 1, que usa un medio químicamente definido (medio LM3) para cultivar bacterias, conteniendo dicho medio químicamente definido (medio LM3) todos los componentes del medio de la reivindicación 20 en cantidades de tres veces, excepto los fosfatos y acetato de sodio, cuyas cantidades respectivas se mantienen al mismo nivel que en el medio LM1.

23. El método de la reivindicación 1, que usa un medio químicamente definido (medio LM5) para cultivar bacterias, conteniendo dicho medio químicamente definido (medio LM5) todos los componentes del medio de la reivindicación 20 en cantidades de cinco veces, excepto los fosfatos y acetato de sodio, cuyas cantidades respectivas se mantienen al mismo nivel que en el medio LM1.

24. El método de la reivindicación 1, que usa un medio químicamente definido como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 20-23, que contiene adicionalmente glucosa en una cantidad en el intervalo de 1-100 g/l.

25. Un método según la reivindicación 12, en el que el medio químicamente definido es el medio definido en cualquiera de las reivindicaciones 20, 22-24.