Método de detección de quinolonas en alimentos y materiales biológicos.

Esta invención tiene por objeto un nuevo método de ensayo microbiológico para la detección de la presencia o ausenciade antibióticos de la familia de las quinolonas en muestras biológicas tales como leche, huevo, carne, miel, pienso, suero y orina. En la invención se ha ideado un nuevo método basado en la inhibición del crecimiento del microorganismo Escherichia coli ATCC 11303 en presencia de muestras contaminadas con residuos de quinolonas. El ensayo se realiza en un formato de tubo lo que permite el análisis de grandes series de muestras. La inhibición del crecimiento es detectada a través de un indicador de metabolismo. Este nuevo método de ensayo permite la detección de las quinolonas en concentraciones inferiores o iguales a los Límites Máximos de Residuos (LMRs) permitidos en alimentos destinados al consumo humano en la Unión Europea

Método de detección de quinolonas en alimentos y materiales biológicos.

Sector de la técnica

La invención se encuadra en el sector agroalimentario, más concretamente en el relativo a los métodos de análisis.

Estado de la técnica

La detección de residuos de medicamentos veterinarios en alimentos y, especialmente de antibióticos, tiene una gran importancia debido a sus repercusiones en la Salud Pública, así como también sobre algunos procesos tecnológicos de fermentación. El uso de este tipo de substancias en el sector ganadero es habitual, tanto con fines terapéuticos como con objeto de mejorar los rendimientos productivos. Estos tratamientos pueden dar lugar a la presencia de antibióticos en los alimentos, que incluso pueden encontrarse en concentraciones por encima de los Límites Máximos de Residuo (LMR) establecidos según el Reglamento (CEE) 2377/90 de la Unión Europea.

En la actualidad, es posible determinar específicamente la presencia de residuos de antibióticos alimentos mediante técnicas inmunoquímicas, de receptores biológicos o bien instrumentales como el HPLC, pero no existe ningún método para la detección de residuos de antibióticos en alimentos que reúna todos los requisitos de un método ideal (amplio espectro de sensibilidad, rapidez, coste asequible, no aparición de falsos negativos, utilización por usuarios sin experiencia especifica, etc) En ese sentido, por su sencillez y bajo coste, las técnicas basadas en la inhibición del crecimiento microbiano son las más ampliamente utilizadas. Dentro de este grupo, las técnicas de bioensayo en placa del tipo del "test de las 4 placas" son las más extendidas. Estas técnicas consisten, básicamente, en la puesta en contacto de la muestra con una placa que contiene un microorganismo de ensayo, los nutrientes necesarios para su crecimiento y un soporte sólido en forma de agar. Cuando la muestra problema contiene un antimicrobiano se formará un halo de inhibición del crecimiento del microorganismo de ensayo que tiene que ser medido. Dentro de éstas técnicas existen variantes en las que se combinan diferentes microorganismos de ensayo (Bacillus subtilis, B. cereus. Geobacilllus stearothermophilus, etc), diferentes medios de crecimiento y diferentes condiciones de cultivo. Sin embargo, estas técnicas microbiológicas presentan el inconveniente común de su gran laboriosidad y la baja capacidad analítica, lo que limita su uso sistemático como método de rutina tanto en laboratorios oficiales como en los laboratorios de la industria alimentaria.

Esta limitación ha sido soslayada, parcialmente, gracias a algunos métodos comerciales listos para usar basados en el uso de Geobacillus stearothermophilus como diana de los antibióticos y la medida de su actividad metabólica mediante un indicador de color tipo ácido-base o de oxido-reducción. El microorganismo de ensayo, el medio de crecimiento y el indicador están contenidos en un tubo de diferentes dimensiones. Cuando se añade la muestra al tubo conteniendo los tres componentes y en las condiciones optimas de crecimiento, el microorganismo será capaz de crecer modificando la composición del medio que será detectado a través del indicador de color. Si la muestra contiene un antimicrobiano el microorganismo diana no será capaz de crecer y por lo tanto de modificar el medio que mantendrá su color inicial. Se han descrito ejemplos de estos ensayos en los documentos ES2263361, EP0005891, EP0611001.

El uso de este tipo de métodos es muy extendido en el análisis de residuos de antibióticos y sulfamidas en el sector lácteo como una etapa inicial de cribado, debido a la elevada sensibilidad del microorganismo diana a los residuos de la familia de los betalactámicos y cefalosporinas que son ampliamente utilizados en la terapéutica del ganado lechero. Las muestras resultantes positivas a estos métodos son posteriormente confirmadas con métodos instrumentales tipo HPLC. Los métodos de inhibición del crecimiento microbiano en tubo se están utilizando también en otros sectores como el cárnico y el de ovoproductos principalmente como una herramienta de autocontrol de la industria alimentaria. Sin embargo, uno de los principales inconvenientes de estos métodos es que presentan una insuficiente sensibilidad a algunos grupos de antibióticos cada vez más empleados en terapéutica veterinaria, como por ejemplo el de la familia de las quinolonas, siendo los umbrales de detección para esta familia de sustancias más de 10 veces superiores a los Limites Máximos de Residuo permitidos por la legislación.

El empleo de las quinolonas se ha incrementado notablemente en las últimas décadas, tanto en el ámbito de la medicina humana como veterinaria. El mecanismo de acción de estos antibióticos se basa en la inhibición de la síntesis del ADN, actuando sobre enzimas que intervienen en sus procesos de síntesis y replicación. Se considera que su diana preferente son las enzimas topoisomerasa II -también denominada DNA girasa- en microorganismos Gram (-) y la topoisomerasa IV en Gram (+). Entre los compuestos que forman parte del grupo de la quinolonas están las siguientes: enrofloxacina, norfoxacina, ciprofloxacina, danofloxacina, marbofloxacina, sarafloxacina, flumequina, ácido oxolinica, ácido nalidixico y difloxacina.

Por otra parte, el "test de las 4 placas" consta de una batería de placas que contienen diferentes microorganismos diana y medios de detección, entre las que se incluye una placa inoculada con E. coli ATCC 11303, específica para la detección de quinolonas. Según diversos autores, la sensibilidad de esta placa es adecuada a los niveles exigidos por la legislación. Sin embargo, este método como se ha mencionado anteriormente presenta los inconvenientes de su gran laboriosidad, la necesidad de mantener cultivos bacterianos frescos y la baja procesabilidad de muestras, lo cual supone un elevado esfuerzo y coste económico para el laboratorio.

Por lo tanto sería deseable disponer de un método analítico que permitiese detectar con fiabilidad quinolonas en productos de origen animal, con una sensibilidad adecuada, de fácil implementación por los laboratorios y baja laboriosidad, que permitiese el análisis de numerosos muestras, así como posibilitar su automatización.

La presente invención describe un sistema de detección de quinolonas en alimentos y muestras biológicas, en formato de tubo, que permite simplificar el análisis. Este método incluye el microorganismo de ensayo Escherichia coli ATCC 11303 como diana para la detección, un medio adecuado de crecimiento, un indicador de metabolismo microbiano y unas condiciones optimas de realización del ensayo. En las condiciones adecuadas de crecimiento el microorganismo de ensayo es capaz de metabolizar los nutrientes del medio y como consecuencia modificar el color del indicador de metabolismo de azul a amarillo. Cuando la muestra contiene una o varias quinolonas, el microorganismo no será capaz de crecer y por lo tanto el medio conservará el color azul original. Además, se demuestra que el método descrito es capaz de detectar los residuos de quinolonas específicamente y con unos umbrales de detección adecuados a los requerimientos legislativos de la Unión Europea en cuanto a los límites máximos de residuos (LMR). Por otra parte, esta metodología puede ser aplicada al análisis de rutina permitiendo el análisis de grandes series de muestras, e incluso la automatización de los procesos de análisis.

Descripción detallada de la invención

El método de ensayo para la detección de quinolonas en alimentos y materiales biológicos, objeto de esta memoria, reivindica la utilización de Escherichia coli ATCC 11303 como microorganismo de ensayo acoplado a un medio de crecimiento adecuado y a un indicador de metabolismo, en un formato de tubo, que permita detectar una o varias quinolonas, entre otras la enrofloxacina, ciprofloxacina, norfoxacina, y sarafloxacina, en muestras biológicas, como por ejemplo leche, huevo, jugo de carne y vísceras, miel, suero u orina. Este nuevo método comprende la puesta en contacto de la muestra a analizar con el microorganismo de ensayo, Escherichia coli ATCC 11303 y la provisión de las condiciones de realización del ensayo en las que: en ausencia de compuestos de la familia de las quinolonas la actividad metabólica de dicho microorganismo suceda y pueda ser detectada; y en presencia de compuestos de la familia de las quinolonas dicha actividad metabólica sea inhibida y por tanto, no pueda ser detectada.

El medio de crecimiento o de ensayo puede ser un medio sólido, como por ejemplo un medio...

1. Método para detectar una o más quinolonas presentes en una muestra biológica basado en la inhibición de la actividad metabólica del microorganismo Escherichia coli cepa ATCC 11303, medible mediante un indicador y que comprende:

a) la puesta en contacto de dicha muestra biológica con el microorganismo de ensayo y el indicador de crecimiento metabólico, en un soporte o unidad de ensayo,

b) la provisión de las condiciones de realización del ensayo en las que en ausencia de compuestos antimicrobianos de la familia de las quinolonas la actividad metabólica de dicho microorganismo de ensayo suceda y pueda ser detectada mediante un indicador; y en presencia de compuestos antimicrobianos de la familia de las quinolonas dicha actividad metabólica sea inhibida y por tanto, no pueda ser detectada.

2. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque el medio de ensayo puede ser un medio sólido, como por ejemplo un agar, o líquido, como por ejemplo un caldo nutritivo, al que se le añade el microorganismo de ensayo Escherichia coli cepa ATCC 11303, los nutrientes necesarios para soportar el crecimiento de dicho microorganismo y un indicador de la actividad metabólica.

3. Método según la reivindicación 2, caracterizado porque todos o parte de los componentes citados pueden ser añadidos al medio de ensayo por separado mediante una solución liquida, un liofilizado, en una pastilla o en un disco de papel.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el microorganismo del ensayo se añade al medio de ensayo preferentemente en una concentración de entre 102 a 106 UFC/mL, lo que permite modificar el tiempo de realización del ensayo y su sensibilidad a las distintas quinolonas.

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el indicador de la actividad metabólica puede ser un indicador ácido-base o uno o varios indicadores redox.

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque es capaz de detectar en menos de 24 horas la presencia de enrofloxacina, sarafloxacina y ciprofloxacina a 100 micro-g/L.

7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el volumen de medio de ensayo está comprendido entre 10 micro-L y 5 mL y el volumen de muestra a poner en contacto con el medio de ensayo está comprendido entre 10 micro-L y 2 mL.

8. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la temperatura óptima de ensayo está comprendida entre 30 y 45ºC, con mayor preferencia entre 35 y 39ºC.

9. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque utiliza como soporte para el medio de ensayo un tubo de entre 3-100 mm de altura y 1-20 mm de sección trasversal, una placa de microtitulación, una cubeta de espectrofotómetro o un bloque con hendiduras tubulares u otra forma, que alojen el medio de ensayo.

10. Método según las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la lectura de los resultados puede obtenerse visualmente o mediante la medida fotométrica de los cambios de color experimentados por el medio de ensayo.