INMUNOSUPRESOR BASADO EN LA INTERRUPCION DE LA INTERACCION TCR-NCK.

Inmunosupresor basado en la interrupción de la interacción TCR-Nck.

La presente invención se refiere a un compuesto de fórmula estructural (I) y sus derivados, para su uso como medicamento. Preferiblemente como agente inmunosupresor basado en la interrupción de la interacción TCR-Nck

Inmunosupresor basado en la interrupción de la interacción TCR-Nck.

La presente invención se refiere a un compuesto de fórmula estructural (I)

y sus derivados, para su uso como medicamento. Preferiblemente como agente inmunosupresor basado en la interrupción de la interacción TCR-Nck.

Estado de la técnica anterior

Los linfocitos T desempeñan un papel central en el rechazo de alotransplantes y, de forma más o menos directa, en la generación de enfermedades autoinmunes. Por ello los fármacos inmunosupresores actuales basan su mecanismo de acción en la inhibición de la activación de los linfocitos T. Estos inmunosupresores presentan alta toxicidad, debido a que no inhiben vías linfocitarias de modo especifico.

Los linfocitos T son activados a través del receptor para antígeno (TCR) que reconoce al complejo principal de histocompatibilidad (MHC) del órgano transplantado como extraño. El TCR está formado por 6 subunidades, dos de las cuales (TRCa y TCRß) son responsables del reconocimiento de MHC unido a péptidos antigénicos, mientras que las otras cuatro (CD3?, CD3d, CD3e y CD3?) son responsables de la transmisión de señales al citoplasma del linfocito (revisado en Alarcon, B., Gil, D., Delgado, P. and Schamel, W.W. (2003) Immunol Rev, 191, 38-46). Uno de los procesos iniciales que ocurren tras la ligación del TCR por parte del MHC es la activación de las tirosina quinasas de la familia src, Lck y Fyn, que fosforilan las tirosinas de los motivos ITAM de las subunidades de CD3, que a su vez se convierten en sitios de anclaje de las tirosina quinasas de la familia Syk (ZAP70 y Syk). Hasta hace poco se pensaba que éste era el esquema lineal de transmisión de señales, y que a partir de las quinasas de la familia Syk (ZAP70 sobre todo) se producía la divergencia en la cascada de activación que resulta en la activación de diversos factores de transcripción, incluido NFAT, blanco de los fármacos inmunosupresores ciclosporina A y FK506 (Lin, J. and Weiss, A. (2001) J Cell Sci, 114, 243-244). Por su parte, los autores de la presente invención descubrieron hace algunos años que, para activarse, el TCR sufre un cambio conformacional que resulta en el reclutamiento del adaptador Nck directamente a una secuencia rica en prolinas (PRS) de la subunidad CD3e (Gil, D., Schamel, W.W., Montoya, M., Sanchez-Madrid, F. and Alarcon, B. (2002) Cell, 109, 901-912). Esta interacción TCR-Nck se determinó como esencial para la activación de TCR mediante experimentos de sobre-expresión del dominio SH3.1 amino-terminal de Nck (el que se une a CD3e) y mediante la introducción en los linfocitos T de el anticuerpo APA1/1, que se une a PRS y lo bloquea.

Explicación de la invención

Un problema importante con los inmunosupresores actuales es su toxicidad, debido a que no inhiben vías linfocitarias de modo especifico.

La presente invención proporciona un compuesto inmunosupresor más específico de linfocitos T y con menos efectos secundarios que los actualmente existentes, basado en la interrupción de la interacción TCR-Nck.

Para seleccionar el compuesto de la presente invención, se ha tenido en cuenta tanto el cambio conformacional del TCR, como el mecanismo de inicio de la transmisión de señales, paso fundamental para el reclutamiento de proteínas efectoras.

El cambio conformacional en el TCR, que ocurre tras la unión de anticuerpos estimuladores y de MHC, se puso primeramente de manifiesto mediante un ensayo de "pull-down", donde el TCR se une de forma inducible a una matriz de la proteína de fusión GST-Nck. Este ensayo bioquímico no permite identificar de forma individual aquellas células cuyo TCR está sufriendo el cambio conformacional. Sin embargo, los autores de la presente invención demostraron que el anticuerpo APA1/1 también reconoce el cambio conformacional (Risueno, R.M., Gil, D., Fernandez, E., Sanchez-Madrid, F. and Alarcon, B. (2005) Blood, 106, 601-608). El anticuerpo se puede utilizar en preparaciones de linfocitos T en cultivo y también en cortes inmunohistoquímicos. Este reactivo permite demostrar por otro procedimiento distinto al "pull-down" la existencia del cambio conformacional, además de demostrar que el cambio conformacional ocurre in vivo. Es más, el anticuerpo reconoce las sinapsis inmunitarias formadas entre linfocitos T y células presentadoras de antígeno cargadas con un péptido agonista, pero no las sinapsis formadas por un agonista parcial/antagonista. Estos datos sugieren que el cambio conformacional en el TCR podría estar detrás de la distinción entre agonistas fuertes y débiles por parte de los linfocitos T y podría activar cascadas de activación específicas durante el reconocimiento de ligandos fuertes. Esta hipótesis parece corroborada por el hecho de que durante el desarrollo tímico el cambio conformacional (visualizado mediante tinción con APA1/1) ocurre durante el reconocimiento de ligandos que inducen selección negativa, pero no durante el reconocimiento de ligandos que inducen selección positiva (Risueno, R.M., van Santen, H.M. and Alarcon, B. (2006) Proc Natl Acad Sci U S A., 103, 9625-9630). Por otra parte, la única consecuencia conocida del cambio conformacional en el TCR es la exposición de la PRS en CD3e, aunque no se descarta que el cambio conformacional se transmita también a las regiones citoplasmáticas de las otras subunidades CD3 e influya globalmente en todo el proceso de iniciación de la transmisión de señales por el TCR, incluyendo la fosforilación en las tirosinas de los ITAMs (Minguet, S., Swamy, M., Alarcon, B., Luescher, I.F. and Schamel, W.W. (2007) Immunity., 26, 43-54). Sin embargo, el reclutamiento de Nck a la PRS de CD3e constituye un posible mecanismo de la transmisión del cambio conformacional a rutas de activación intracelulares (Gil, D., Schamel, W.W., Montoya, M., Sanchez-Madrid, F. and Alarcon, B. (2002) Cell, 109, 901-912).

Con el fin de demostrar la importancia de la interacción Nck-CD3e en la activación de linfocitos T y validar esta interacción como blanco de agentes inmunomoduladores, se ha procedido al diseño de péptidos sintéticos que mimetizaran la secuencia del PRS y que pudieran bloquear el sitio de unión en Nck a CD3e. Se ha obtenido así un péptido, denominado 11R085, que es 300 veces más potente que un péptido con la secuencia silvestre en la inhibición de la interacción de CD3e con el dominio SH3.1 de Nck. Utilizando este péptido, se consigue inhibir de forma específica la proliferación de linfocitos T humanos tanto CD4+ como CD8+ en respuesta a la estimulación con anticuerpos anti-CD3, con una IC50 de aproximadamente 20 µM, mientras que la proliferación de linfocitos T humanos dependiente de un recep-tor diferente, el IL2R, no es prácticamente afectada por dicho péptido, incluso a concentraciones 3 veces superiores.

Por tanto, el péptido 11R085 inhibe la activación iniciada por el TCR pero no la activación mediada por otro receptor, y por ello, es específico del blanco molecular para el que está diseñado.

El péptido 11R085 también inhibe la producción de IL2 y la proliferación inducida por antígeno en linfocitos primarios de ratones transgénicos OT-I con una IC50 de aproximadamente 5 µM. Queda así validada la interacción Nck-CD3e como blanco molecular para el desarrollo de inmunosupresores.

A partir de esto hecho, y utilizando estrategias bioinformáticas de selección se realizó un cribado virtual de compuestos que se unen al dominio SH3.1, tal y como se describe en los ejemplos de la invención. Tras este cribado, se seleccionaron los diez que teóricamente encajaban mejor en un bolsillo hidrofóbico del SH3.1, encargado del reconocimiento de la secuencia PRS de CD3e (ver Fig. 1). Todos estos compuestos, estrucuturalmente muy diferentes, tuvieron un cierto grado de actividad, pero el que presenta un mayor grado de actividad y menos toxicidad, incluso a dosis altas, (Fig.7), es el compuesto denominado CBM-1,compuesto de formula estructural (I).

El compuesto CBM-1 presentó buena actividad y capacidad inmunosupresora, CBM-1 inhibe la proliferación de linfocitos T humanos inducida por anticuerpos anti-CD3 pero no la proliferación dependiente de IL2. Asimismo, inhibe la proliferación de linfocitos T de ratón dependiente de antígeno y también inhibe la liberación de IL2. En linfocitos humanos estimulados con anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 inhibe la producción de IFN?, de IL-10...

1. Compuesto de fórmula (I):

y cualquiera de sus derivados para su uso como medicamento.

2. Uso del compuesto según reivindicación 1 para preparar un medicamento.

3. Uso del compuesto según reivindicación 2 para preparar un medicamento para el tratamiento y/o prevención de enfermedades que cursen con la activación de linfocitos T ó con la hiperproliferación o proliferación anormal de los mismos.

4. Uso del compuesto según reivindicación 3, donde las enfermedades que cursan con la activación de linfocitos T son enfermedades autoinmunes.

5. Uso del compuesto según reivindicación 4 donde las enfermedades autoinmunes se seleccionan de la lista que comprende: esclerosis múltiple y sus variedades, lupus eritematoso sistémico, psoriasis, vitíligo, artritis reumatoide, asma, psoriasis, hepatitis autoinmune, diabetes de tipo I, miastenia gravis, espondilitis anquilosante y enfermedad de Crohn.

6. Uso del compuesto según reivindicación 3 donde las enfermedades que cursan con la activación de linfocitos T, son enfermedades que cursan con rechazo de alotransplantes ó xenotransplantes de órganos ó tejidos.

7. Uso del compuesto según reivindicación 3 donde las enfermedades que cursan con la activación de linfocitos T, son linfomas o leucemias T.

8. Composición farmacéutica que comprende el compuesto según reivindicación 1 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

9. Uso de la composición farmacéutica según reivindicación 6 como inmunosupresor.