Un método para preparar un andamiaje para implantación in vivo,

que comprende la etapa de revestir una matriz estructural con un ligando de un receptor o un fragmento de dicho ligando que comprende el dominio de unión al receptor, seleccionado del grupo de ligandos que consiste en factor derivado del estroma 1, factor de células pluripotenciales, VCAM-1, región P1 de fibrinógeno y región P2 de fibrinógeno

Ingeniería con factores orientadores.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a la ingeniería tisular y a la siembra celular de andamiajes de dispositivos implantables. La invención se refiere además a moléculas que aseguran la siembra in vitro y/o in vivo de una matriz con células.

Antecedentes

Las válvulas cardíacas protésicas sufren posibles complicaciones tales como trombosis, endocarditis, fallo mecánico, degradación tisular, calcificación. Estos problemas y el hecho de que estas prótesis carezcan de potencial de crecimiento y remodelación en pacientes pediátricos son el motivo de la ingeniería tisular de las válvulas cardíacas.

El principal objetivo de la ingeniería tisular es la restauración de la función mediante el aporte de elementos vivos que se incorporan al paciente. La ingeniería tisular se basa esencialmente en 3 elementos:

- células, que representan el componente vivo

- matriz, que proporciona una estructura de soporte tridimensional

- moléculas de señalización que influyen en la expresión génica y la deposición de la matriz extracelular.

La ingeniería tisular combina células y andamiajes para construir nuevo tejido. Para la siembra celular de matrices, se están investigando actualmente dos opciones: células autólogas cultivadas para la siembra in vitro y la atracción de células autólogas in vivo.

Diferentes matrices se están considerando para la ingeniería tisular (véase la Figura 1). Una matriz puede ser un andamiaje moldeado de un polímero sintético o de colágeno o fibrina. El andamiaje puede ser natural (p. ej. raíz acelular) o puede ser una prótesis reticulada.

Además, se han ideado diferentes procedimientos para obtener una válvula cardíaca viable sometida a ingeniería tisular. El paradigma completo describe la construcción de una válvula al combinar células y andamiaje in vitro, seguido por la maduración in vitro de la construcción en un biorreactor (Figura 2). La construcción madura puede implantarse a continuación en el paciente y posiblemente sufrir remodelación in vivo (revisado en Rabkin & Schoen (2002) Cardiovasc. Pathol. 11, 305-317). La construcción estudiada más a fondo es una válvula creada por Hoerstup et ál. ((2002) Circulation 106, 1143-1150)). Obtuvieron satisfactoriamente una válvula pulmonar de oveja viable y remodelada usando el paradigma completo con un biorreactor.

El documento US2001/051824 se refiere a una válvula cardíaca bioprotésica que comprende una matriz acelular y miofibroblastos aislados.

El documento US6082364 describe implantes o andamiajes metálicos que comprenden células de la médula ósea o similares a las pluripotenciales.

El documento WO2004/090120 se refiere a células pluripotenciales que exhiben una sensibilidad incrementada a un quimioatrayente.

El documento WO9941403 divulga una composición de interés para introducir una molécula de ácido nucleico exógena en una célula diana que comprende un liposoma, un ligando y un andamiaje polímero, en la que dicho ligando puede unirse a un receptor de la superficie celular o una molécula expresada por una célula diana.

Campbell et ál. ((1999) Circ. Res. 85, 1173-1178) han sugerido asegurar la siembra de andamiajes en la ingeniería tisular de vasos sanguíneos haciendo uso de un mecanismo de defensa conocido, a saber la reacción a cuerpos extraños. Una reacción madura a cuerpos extraños está comprendida por una capa de macrófagos, varias capas de fibroblastos y una capa mesotelial externa (Butler et ál. (2001 a) Biomed. Sci. Instrum. 37, 19-24.; Butler et ál. (2001 b) J. Invest Surg. 14, 139-152). Aunque Campbell et ál. (1999, citado anteriormente) afirman que los fibroblastos se derivan de macrófagos transdiferenciados, todavía no se ha publicado una evidencia concluyente.

Para que sean satisfactorios, estos métodos tienen que cumplir un número de retos reguladores, incluyendo una función y una durabilidad óptimas. Para justificar el alto coste de las válvulas sometidas a ingeniería tisular, deben demostrar tener cualidades superiores a las válvulas existentes. Adicionalmente, todas las técnicas mencionadas anteriormente tienen que vencer el reto de la bioseguridad. Las cuestiones y las bases de la bioseguridad en lo que respecta a la FDA están bien documentadas ("Guidance on applications for products comprised of living autologous cells manipulated ex vivo and intended for structural repair or reconstruction". 95N-0200 (1996); "Proposed approach to regulation of cellular and tissue-based products - The food and drug administration". Journal de Hematotherapy 6:195-212 (1997); "Guidance for industry - Guidance for human somatic cell therapy and gene therapy". Human Gene Therapy 9:1513-1524 (1998); "PHS guideline on infectious disease issues in xenotransplantation". (2001); "Transmissible spongiform encephalopathies advisory committee meeting". (2001)).

El uso de células cultivadas o incluso recogidas in vitro plantea problemas específicos. Según se ilustra en la Figura 3, tanto la recogida como el cultivo de células pueden inducir inestabilidad genética o mutagénesis. Esto puede atribuirse a diferentes factores. Tanto la recogida como el cultivo requieren generalmente el uso de proteínas extrañas. El origen xenogénico de las enzimas o los sueros proteolíticos es una fuente potencial de contaminación por patógenos entre especies. Tal contaminación, si no se detecta, no solo pone en riesgo el propio cultivo, sino también al receptor. El mecanismo de proliferación de ciertos virus puede permitir la inserción de su genoma en el genoma del huésped, lo que puede provocar mutaciones perjudiciales dependiendo del sitio de inserción. Ciertos genes virales también pueden actuar como oncogenes. Las cuestiones de bioseguridad se aplican igualmente al uso de materiales xenogénicos. Además del riesgo de infecciones virales, el cultivo de células también expone a las células a condiciones no fisiológicas tales como una tensión de oxígeno incrementada. De media, el tejido de los mamíferos está expuesto a una tensión de oxígeno que varía de 2-8%, mientras que las incubadoras generalmente usan aire comprimido con una tensión de oxígeno de 21%. Se ha demostrado que los fibroblastos múridos primarios son extremadamente vulnerables al daño al DNA que da como resultado senescencia e inmortalización espontánea. A pesar del hecho de que en estos experimentos los fibroblastos humanos estaban mucho menos afectados, otros estudios demuestran que las células humanas no son insensibles al estrés oxidativo. Por ejemplo, los condrocitos de cartílago articular humano han demostrado ser sensibles al estrés oxidativo. Usando líneas celulares, se ha demostrado que el oxígeno induce predominantemente reagrupamientos genómicos en células que proliferan rápidamente. Por otra parte, se ha demostrado que los fibroblastos humanos también sufren senescencia en respuesta al estrés oxidativo, lo que puede provocar acortamiento del telómero y roturas de la hebra simple en el DNA telómero a una velocidad que depende del estrés oxidativo. En cultivos de fibroblastos, se obtuvo un incremento en los doblamientos de población cuando se disminuía la tensión de oxígeno. Otra observación notable es que la senescencia regula al alza ocho genes entre los que se encuentran fibronectina, osteonectina y procolágeno alfa1.

La bioseguridad es un aspecto muy importante de los retos reguladores para válvulas cardíacas sembradas con células in vitro e impone el desarrollo de un control de calidad restrictivo para cada prótesis valvular individual antes de la implantación en el receptor. Los retos reguladores incrementados también incrementarán notablemente los costes de tales prótesis, limitando de ese modo su uso a grupos específicos de pacientes.

Existe una necesidad en la técnica de un modo para obtener válvulas cardíacas y otros dispositivos implantables sometidos a ingeniería tisular viables. Más particularmente, existe una necesidad de andamiajes que sean adecuados para la siembra celular, particularmente la siembra celular in vivo, lo más particularmente cuando se necesita que la siembra celular se produzca bajo condiciones de estrés por cizalladura incrementado, tales como andamiajes de válvulas cardíacas y vasos sanguíneos.

Compendio de la invención

La presente invención se refiere generalmente al uso de factores orientadores...

1. Un método para preparar un andamiaje para implantación in vivo, que comprende la etapa de revestir una matriz estructural con un ligando de un receptor o un fragmento de dicho ligando que comprende el dominio de unión al receptor, seleccionado del grupo de ligandos que consiste en factor derivado del estroma 1, factor de células pluripotenciales, VCAM-1, región P1 de fibrinógeno y región P2 de fibrinógeno.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el andamiaje es un andamiaje para válvulas cardíacas o vasos sanguíneos.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el que la matriz estructural es biodegradable.

4. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que no comprende la etapa de revestir la matriz estructural con factores quimioatrayentes o factores de movilización.

5. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende además la etapa de revestir la matriz estructural con uno o más factores quimioatrayentes y/o factores de movilización.

6. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende además la etapa de prerrevestir la matriz del andamiaje con una o más proteínas que facilitan la interacción entre el ligando o su fragmento y la matriz estructural.

7. El método de acuerdo con la reivindicación 6, en el que el ligando o su fragmento y la proteína que facilita la interacción con la matriz estructural se revisten sobre la matriz como una proteína de fusión.

8. El método de acuerdo con la reivindicación 6 ó 7, en el que la proteína facilitadora se selecciona del grupo que consiste en fibronectina, colágeno y fibrinógeno.

9. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dicho ligando o su fragmento se reviste en dicha matriz estructural por medio de un brazo conector.

10. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la matriz estructural es una prótesis no reticulada o raíces aórticas acelularizadas.

11. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que la etapa de revestir la matriz estructural con el ligando aislado o su fragmento se realiza mediante reticulación química o mediante impregnación de la matriz con una solución que comprende el ligando o su fragmento.

12. Un andamiaje para implantación in vivo que comprende una matriz estructural, caracterizado porque dicha matriz está revestida con uno o más ligandos de receptores, o fragmentos de dichos ligandos que comprenden el dominio de unión al receptor, seleccionados del grupo de ligandos que consiste en factor derivado del estroma 1, factor de células pluripotenciales, VCAM-1, región P1 de fibrinógeno y región P2 de fibrinógeno.

13. El andamiaje de acuerdo con la reivindicación 12, en el que dicho andamiaje es un andamiaje de un vaso sanguíneo o una válvula cardíaca.

14. El andamiaje de acuerdo con la reivindicación 12 ó 13, que comprende además factores quimioatrayentes y/o factores de movilización.

15. El andamiaje de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, en el que dicho andamiaje está revestido además con una o más proteínas que facilitan la interacción entre el ligando o su fragmento y la matriz estructural.

16. El andamiaje de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15, en el que la matriz estructural es una prótesis no reticulada o raíces aórticas acelularizadas.

17. El andamiaje de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 16, en el que el ligando o su fragmento está químicamente reticulado a la matriz estructural.

18. Un estuche para el desarrollo de un andamiaje que comprende una matriz estructural para un injerto y uno o más ligandos de receptores, o fragmentos de dichos ligandos que comprenden el dominio de unión al receptor, seleccionados del grupo de ligandos que consiste en factor derivado del estroma 1, factor de células pluripotenciales, VCAM-1, región P1 de fibrinógeno y región P2 de fibrinógeno.

19. El estuche de acuerdo con la reivindicación 18, en el que el injerto está en la forma de un vaso sanguíneo o una válvula cardíaca.

20. Uso de un ligando de un receptor o un fragmento de dicho ligando que comprende el dominio de unión al receptor, seleccionado del grupo de ligandos que consiste en factor derivado del estroma 1, factor de células pluripotenciales, VCAM-1, región P1 de fibrinógeno y región P2 de fibrinógeno, para preparar una matriz estructural en la forma de un dispositivo implantable.

21. El uso de acuerdo con la reivindicación 20, en el que el dispositivo es una válvula cardíaca o un injerto vascular.

22. Uso de un ligando de un receptor o un fragmento de dicho ligando que comprende el dominio de unión al receptor, seleccionado del grupo de ligandos que consiste en factor derivado del estroma 1, factor de células pluripotenciales, VCAM-1, región P1 de fibrinógeno y región P2 de fibrinógeno, para la fabricación de un andamiaje que comprende una matriz estructural, para el tratamiento de un tejido, un vaso o un órgano enfermo o dañado.

23. Un andamiaje que comprende una matriz estructural revestida con uno o más ligandos de receptores, o fragmentos de dichos ligandos que comprenden el dominio de unión al receptor, seleccionados del grupo de ligandos que consiste en factor derivado del estroma 1, factor de células pluripotenciales, VCAM-1, región P1 de fibrinógeno y región P2 de fibrinógeno, para tratar un tejido, vaso u órgano enfermo o dañado.

24. El uso de acuerdo con la reivindicación 22 o el andamiaje de acuerdo con la reivindicación 23, en el que dicho andamiaje es un andamiaje de válvula cardíaca o vaso sanguíneo.