GENES DE HIALURONANO SINTASA Y EXPRESION DE LOS MISMOS.
Una célula huésped recombinante, en que la célula huésped recombinante es una célula de Bacillus que comprende:
un vector recombinante que comprende un segmento purificado de ácido nucleico que tiene una región de codificación que codifica una hialuronano sintasa enzimáticamente activa, en que la región de codificación está bajo el control de un promotor, y en que el segmento purificado de ácido nucleico es seleccionado del grupo que consiste en:
(A) un segmento purificado de ácido nucleico de acuerdo con la ID. SEC. nº 11;
(B) un segmento purificado de ácido nucleico que comprende una región de codificación que codifica la hialuronano sintasa enzimáticamente activa de la ID. SEC. nº 12; y
(C) un segmento purificado de ácido nucleico que tiene una identidad de entre 90% y 99% con respecto a la ID. SEC. nº 11 y comprende cambios conservativos o semiconservativos de codones de aminoácidos cuando se compara con la ID. SEC. nº 11, siendo dichos cambios la sustitución de uno o más codones nucleotídicos que codifican un aminoácido de uno o más de los grupos siguientes por un codón que codifica otro aminoácido del mismo grupo:
Grupo A:alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, metionina, fenilalanina y triptófano;
Grupo B:glicocola, serina, treonina, cisteína, asparagina y glutamina;
Grupo C:ácido aspártico y ácido glutámico;
Grupo D:lisina, arginina e histidina; y
un vector recombinante que comprende un segmento purificado de ácido nucleico que tiene una región de codificación que codifica una enzima enzimáticamente activa de la ruta biosintética de UDP-GlcUA, en que la enzima enzimáticamente activa de la ruta biosintética de UDP-GlcUA es seleccionada del grupo que consiste en UDP-glucosa deshidrogenasa, UDP-glucosa pirofosforilasa y combinaciones de las mismas
Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US02/18915.
Solicitante: THE BOARD OF REGENTS OF THE UNIVERSITY OF OKLAHOMA.
Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.
Dirección: 660 PARRINGTON OVAL,NORMAN, OK 73019.
Inventor/es: WEIGEL, PAUL, H., KUMARI, KSHAMA, DEANGELIS,PAUL L.
Fecha de Publicación: .
Fecha Concesión Europea: 9 de Junio de 2010.
Clasificación PCT:
- C12N15/54 QUIMICA; METALURGIA. › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Transferasas (2).
- C12N9/10 C12N […] › C12N 9/00 Enzimas, p. ej. ligasas (6.); Proenzimas; Composiciones que las contienen (preparaciones para la limpieza de los dientes que contienen enzimas A61K 8/66, A61Q 11/00; preparaciones de uso médico que contienen enzimas A61K 38/43; composiciones detergentes que contienen enzimas C11D ); Procesos para preparar, activar, inhibir, separar o purificar enzimas. › Transferasas (2.) (ribonucleasas C12N 9/22).
- C12P19/04 C12 […] › C12P PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN ENZIMAS PARA LA SINTESIS DE UN COMPUESTO QUIMICO DADO O DE UNA COMPOSICION DADA, O PARA LA SEPARACION DE ISOMEROS OPTICOS A PARTIR DE UNA MEZCLA RACEMICA. › C12P 19/00 Preparación de compuestos que contienen radicales sacárido (ácido cetoaldónico C12P 7/58). › Polisacáridos, es decir, compuestos que contienen más de cinco radicales sacárido unidos entre ellos por enlaces glucosídicos.
- C12P19/26 C12P 19/00 […] › Preparación de hidratos de carbono que contienen nitrógeno.
Clasificación antigua:
- C12N1/00 C12N […] › Microorganismos, p.ej. protozoos; Composiciones que los contienen (preparaciones de uso médico que contienen material de protozoos, bacterias o virus A61K 35/66, de algas A61K 36/02, de hongos A61K 36/06; preparación de composiciones de uso médico que contienen antígenos o anticuerpos bacterianos, p. ej. vacunas bacterianas, A61K 39/00 ); Procesos de cultivo o conservación de microorganismos, o de composiciones que los contienen; Procesos de preparación o aislamiento de una composición que contiene un microorganismo; Sus medios de cultivo.
Fragmento de la descripción:
Genes de hialuronano sintasa y expresión de los mismos.
Fundamento del invento
El presente invento se refiere a un segmento de ácido nucleico que tiene una región de codificación que codifica una hialuronato sintasa (HAS) enzimáticamente activa, y al uso de este segmento de ácido nucleico en la preparación de células recombinantes que producen hialuronato sintasa y su producto, ácido hialurónico. El hialuronato es también conocido como ácido hialurónico e hialuronano.
La incidencia de infecciones estreptocócicas es un importante problema sanitario y económico mundial, particularmente en los países en desarrollo. Una razón de esto es la capacidad de las bacterias estreptocócicas para crecer sin ser detectadas por las células fagocíticas, es decir, macrófagos y células polimorfonucleares (PMNs; del inglés, polymorphonuclear cells), del organismo. Estas células son responsables de reconocer y engullir microorganismos extraños. Un modo eficaz que tienen las bacterias para eludir la vigilancia es mediante su revestimiento con cápsulas polisacáridas, tal como con una cápsula de ácido hialurónico (HA; del inglés, hyaluronic acid). La estructura del HA es idéntica tanto en procariotas como en eucariotas.
Puesto que el HA es generalmente no inmunogénico, las bacterias encapsuladas no provocan una respuesta inmune y, por lo tanto, no son un objetivo de destrucción. Además, la cápsula ejerce un efecto antifagocítico sobre PMNs in vitro y evita la fijación del estreptococo a macrófagos. A causa precisamente de esto, en los estreptococos del Grupo A y el Grupo C, las cápsulas de HA son importantes factores de virulencia en las infecciones naturales y experimentales. Los estreptococos del Grupo A son responsables de numerosas enfermedades humanas, incluyendo faringitis, impétigo, infecciones de tejidos profundos, fiebre reumática y un síndrome de tipo choque tóxico. El Streptococcus equisimilis del Grupo C es responsable de osteomielitis, faringitis, abscesos cerebrales y neumonía.
Estructuralmente, el HA es un polisacárido lineal de alto peso molecular compuesto por unidades disacáridas repetitivas que consisten en N-acetilglucosamina (GlcNAc) y ácido glucurónico (GlcUA). En una molécula de HA, el número de disacáridos repetitivos puede exceder de 30.000, un Mr > 107. El HA es el único glicosaminoglicano sintetizado tanto por células de mamífero como por células bacterianas, particularmente por estreptococos de los Grupos A y C y por Pasteurella multocida del Tipo A. Estas cepas generan HA que es secretado al medio, así como cápsulas de HA. El mecanismo por el cual estas bacterias sintetizan HA tiene un gran interés medicinal ya que la producción de la cápsula de HA es un modo muy eficaz e ingenioso que usan los estreptococos para eludir la vigilancia del sistema inmune. Además, moléculas orgánicas o inorgánicas revestidas con HA tienen unas propiedades que les permiten escapar de la detección y destrucción por el sistema inmune del huésped.
El HA es sintetizado por la enzima hialuronato sintasa de células de mamífero y bacterianas, que se ha localizado en la membrana plasmática. Se cree que la síntesis de HA en estos organismos es un proceso de múltiples pasos. El inicio implica la unión de un precursor inicial, UDP-GlcNAc o UDP-GlcUA. Esto va seguido de un alargamiento que implica la adición alterna de los dos azúcares a la cadena oligosacárida en crecimiento. El polímero en crecimiento se extruye a través de la región de la membrana plasmática de la célula y en el espacio extracelular. Aunque el sistema biosintético del HA fue una de las primeras rutas sintéticas de heteropolisacárido de membrana estudiadas, el mecanismo de la síntesis de HA no está aún bien entendido. Esto se puede deber a que los sistemas in vitro desarrollados hasta la fecha son inadecuados porque no se ha conseguido la biosíntesis de novo del HA.
La dirección del crecimiento del polímero de HA es aún un asunto de desacuerdo entre quienes tienen una experiencia normal en la técnica. La adición de los monosacáridos podría ser al extremo reductor o no reductor de la cadena de HA en crecimiento. Además, quedan cuestiones relativas a (i) si las cadenas nacientes están covalentemente enlazadas a una proteína, a UDP o a un producto intermedio lipídico, (ii) si las cadenas se inician usando un cebador, y (iii) el mecanismo por el cual el polímero maduro se extruye a través de la membrana plasmática del estreptococo. El conocimiento del mecanismo de la biosíntesis de HA puede permitir el desarrollo de estrategias alternativas para controlar las infecciones por estreptococos y Pasteurella al interferir en el proceso.
El HA ha sido identificado en casi todos los tejidos de los vertebrados y ha alcanzado un uso muy difundido en diversas aplicaciones clínicas, muy notable y apropiadamente como un suplemento de matriz intraarticular y en cirugía ocular. La bibliografía científica también ha mostrado una transición, desde la percepción original de que el HA es esencialmente un componente estructural pasivo de la matriz de unos pocos tejidos conjuntivos y de la cápsula de ciertas cepas de bacterias, hasta el reconocimiento de que esta macromolécula ubicua está dinámicamente implicada en muchos procesos biológicos: desde modular la migración y la diferenciación celulares durante la embriogénesis para la regulación de la organización y el metabolismo de la matriz extracelular, hasta papeles importantes en los complejos procesos de metástasis, cicatrización de heridas e inflamación. Además, está resultando evidente que el HA es muy metabólicamente activo y que las células ponen mucha atención en los procesos de su síntesis y su catabolismo. Por ejemplo, la semivida del HA en los tejidos varía desde 1 a 3 semanas en el cartílago hasta < 1 día en la epidermis. También se usa HA en numerosas aplicaciones técnicas (por ejemplo, compuestos lubricantes), cosmética y productos nutracéuticos.
Está ahora claro que una sola proteína utiliza ambos sustratos de azúcar para sintetizar HA; es decir, que las HA sintasas son enzimas únicas que tienen propiedades catalíticas dobles. La abreviatura HAS para la HA sintasa ha obtenido un amplio apoyo para designar esta clase de enzimas. Markovitz et al. caracterizaron exitosamente la actividad HAS de Streptococcus pyogenes y descubrieron la localización membranal de la enzima y sus necesidades de precursores de azúcar-nucleótido y de Mg2+. Prehm halló que el HA en alargamiento, generado por células B6, era digerido por hialuronidasa añadida al medio y propuso que la HAS reside en la membrana plasmática. Philipson y Schwartz también mostraron que la actividad HAS era cofraccionada con marcadores de la membrana plasmática en células de oligodendroglioma de ratón.
La HAS ensambla HA de alto Mr que es simultáneamente extruido en el espacio extracelular a través de la membrana (o para generar la cápsula celular en el caso de bacterias) conforme transcurre la síntesis del glicosaminoglicano. Este modo de biosíntesis es único entre las macromoléculas ya que los ácidos nucleicos, las proteínas y los lípidos se sintetizan en el núcleo, el retículo endoplásmico/Golgi, el citoplasma o las mitocondrias. La extrusión de la cadena en crecimiento en el espacio extracelular también permite el crecimiento libre del polímero, consiguiéndose por ello el tamaño excepcionalmente largo del HA, mientras que el confinamiento de la síntesis en un compartimento de Golgi o post-Golgi limita la cantidad o longitud global de los polímeros formados. Las elevadas concentraciones de HA en una abertura confinada también pueden crear un ambiente de alta viscosidad que podría ser deletéreo para otras funciones de los orgánulos.
Mediante diversos estudios se ha intentado solubilizar, identificar y purificar la HAS de cepas de estreptococos que generan un revestimiento capsular de HA, así como de células eucarióticas. Aunque las enzimas estreptocócicas y de oligodendroglioma murino fueron exitosamente solubilizadas con detergente y estudiadas, los esfuerzos para purificar una HAS activa para un estudio o una clonación molecular ulteriores permanecieron infructuosos durante décadas. Prehm y Mausolf usaron UDP-GlcUA o UDP-GlcNAc oxidados con peryodato para marcar por afinidad una proteína de ~ 52 kDa en membranas estreptocócicas que resultaban copurificadas con HAS....
Reivindicaciones:
1. Una célula huésped recombinante, en que la célula huésped recombinante es una célula de Bacillus que comprende:
un vector recombinante que comprende un segmento purificado de ácido nucleico que tiene una región de codificación que codifica una hialuronano sintasa enzimáticamente activa, en que la región de codificación está bajo el control de un promotor, y en que el segmento purificado de ácido nucleico es seleccionado del grupo que consiste en:
un vector recombinante que comprende un segmento purificado de ácido nucleico que tiene una región de codificación que codifica una enzima enzimáticamente activa de la ruta biosintética de UDP-GlcUA, en que la enzima enzimáticamente activa de la ruta biosintética de UDP-GlcUA es seleccionada del grupo que consiste en UDP-glucosa deshidrogenasa, UDP-glucosa pirofosforilasa y combinaciones de las mismas.
2. La célula huésped recombinante de la Reivindicación 1, en que la célula huésped recombinante produce ácido hialurónico.
3. La célula huésped recombinante de la Reivindicación 1, en que la célula huésped recombinante es una célula de Bacillus subtilis o Bacillus licheniformis.
4. La célula huésped recombinante de la Reivindicación 1, en que la región de codificación que codifica la hialuronano sintasa enzimáticamente activa del segmento purificado de ácido nucleico está bajo el control de un promotor compatible con bacterias Gram-positivas.
5. La célula huésped recombinante de la Reivindicación 4, en que el promotor es un promotor compatible con Bacillus.
6. La célula huésped recombinante de cualquiera de las Reivindicaciones 1-5, en que el vector recombinante que comprende un segmento purificado de ácido nucleico que tiene una región de codificación que codifica una hialuronano sintasa enzimáticamente activa comprende además un segmento purificado de ácido nucleico que tiene una región de codificación que codifica UDP-glucosa deshidrogenasa enzimáticamente activa.
7. La célula huésped recombinante de la Reivindicación 6, en que la región de codificación que codifica la HAS enzimáticamente activa y la región de codificación que codifica la UDP-glucosa deshidrogenasa enzimáticamente activa están bajo el control de al menos una copia de al menos un promotor.
8. La célula huésped recombinante de la Reivindicación 6, en que la región de codificación que codifica la HAS enzimáticamente activa y la región de codificación que codifica la UDP-glucosa deshidrogenasa enzimáticamente activa están bajo el control de promotores diferentes.
9. La célula huésped recombinante de cualquiera de las Reivindicaciones 1-8, en que la célula huésped recombinante presenta una producción aumentada de al menos uno de UDP-GlcUA y UDP-GlcNAc.
10. La célula huésped recombinante de la Reivindicación 9, en que la célula huésped recombinante incluye además al menos un promotor de RNA polimerasa modificado, de modo que, cuando el promotor de RNA polimerasa modificado es reconocido por una RNA polimerasa, la RNA polimerasa es capaz de expresar RNA en una cantidad mayor que en el caso de un promotor de RNA polimerasa endógeno, y en que la modificación en el promotor de RNA polimerasa es seleccionada del grupo que consiste en una mutación y elementos promotores en tándem.
11. La célula huésped recombinante de la Reivindicación 9, en que la célula huésped recombinante incluye además al menos uno de:
12. La célula huésped recombinante de la Reivindicación 9, en que la célula huésped recombinante incluye además al menos un segmento de ácido nucleico que tiene una región de codificación que codifica una enzima funcionalmente activa de una ruta para la biosíntesis de precursores de UDP-azúcar, de modo que la célula huésped recombinante tiene una actividad mayor que la de una célula huésped nativa que expresa una enzima endógena de la ruta para la biosíntesis de precursores de UDP-azúcar.
13. La célula huésped recombinante de la Reivindicación 9, en que la célula huésped recombinante incluye además al menos un gen mutado para la biosíntesis de precursores de UDP-azúcar, seleccionado del grupo que consiste en: un gen mutado de precursor de UDP-azúcar que aumenta la semivida de un RNA mensajero transcrito, y un gen mutado de precursor de UDP-azúcar que codifica un RNA mensajero que tiene una eficacia translacional aumentada.
14. La célula huésped recombinante de la Reivindicación 13, en que la mutación en el gen para la biosíntesis de precursores de UDP-azúcar tiene lugar en un sitio de unión al ribosoma del gen para la biosíntesis de precursores de UDP-azúcar, de modo que un ribosoma tiene una afinidad ligante aumentada por el sitio de unión al ribosoma.
15. La célula huésped recombinante de la Reivindicación 1, en que el segmento purificado de ácido nucleico es introducido en la célula de Bacillus mediante al menos una de las técnicas: transformación, transfección, transducción y electroporación.
16. La célula huésped recombinante de la Reivindicación 1, en que el segmento purificado de ácido nucleico que tiene una región de codificación que codifica la hialuronano sintasa enzimáticamente activa es el segmento purificado de ácido nucleico de (A).
17. La célula huésped recombinante de la Reivindicación 1, en que el segmento purificado de ácido nucleico que tiene una región de codificación que codifica la hialuronano sintasa enzimáticamente activa es el segmento purificado de ácido nucleico de (B).
18. Un método para producir ácido hialurónico, que comprende las operaciones de:
proporcionar la célula huésped recombinante de cualquiera de las Reivindicaciones 1-17;
cultivar la célula huésped recombinante en un medio para que secrete ácido hialurónico; y
recuperar el ácido hialurónico secretado.
19. El método de acuerdo con la Reivindicación 18, en que la operación de recuperación del ácido hialurónico comprende extraer del medio el ácido hialurónico secretado.
20. El método de acuerdo con la Reivindicación 19, que comprende además la operación de purificar el ácido hialurónico extraído.
21. El método de acuerdo con la Reivindicación 18, en que la operación de cultivar la célula huésped recombinante en un medio para que secrete ácido hialurónico es adicionalmente definida por ser seleccionada del grupo que consiste en:
22. El método de acuerdo con la Reivindicación 18, en que la operación de recuperar el ácido hialurónico secretado es adicionalmente definida como:
- separar el ácido hialurónico de las células y los fragmentos celulares mediante al menos una de las técnicas: filtración, centrifugación y floculación;
- concentrar el ácido hialurónico separado; y
- separar del medio el ácido hialurónico concentrado mediante al menos un método seleccionado del grupo que consiste en: precipitación, ultrafiltración y diálisis.
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