PRODUCCION DE LA FORMA LIPIDADA DE LAS LIPOPROTEINAS ASOCIADAS A PEPTIDOGLICANO DE BACTERIAS GRAM-NEGATIVAS.

Un plásmido que contiene un promotor estrechamente regulado, en el que dicho promotor está unido operativamente a una secuencia de ADN aislada y purificada que codifica una lipoproteína asociada a un peptidoglicano (LAP) de bacterias gram-negativas,

en el que el promotor es un promotor inducible por arabinosa o un promotor T7

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US00/17020.

Solicitante: AMERICAN CYANAMID COMPANY.

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: FIVE GIRALDA FARMS,MADISON, NEW JERSEY 07940.

Inventor/es: METCALF, BENJAMIN J..

Fecha de Publicación: .

Fecha Concesión Europea: 5 de Mayo de 2010.

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C07K14/285 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C07 QUIMICA ORGANICA.C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02;   proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 14/00 Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados. › de Pasteurellaceae (F), p. ej. Haemophilus influenza.
  • C12N15/70 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN (biocidas, productos que repelen o atraen a los animales nocivos, o reguladores del crecimiento de los vegetales, que contienen microorganismos virus, hongos microscópicos, enzimas, productos de fermentación o sustancias obtenidas por o extraídas de microorganismos o sustancias animales A01N 63/00; preparaciones de uso médico A61K; fertilizantes C05F ); PROPAGACION,CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Vectores o sistemas de expresión especialmente adaptados a E. coli.

Clasificación PCT:

  • A61K39/102 SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA.A61 CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE.A61K PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO (dispositivos o métodos especialmente concebidos para conferir a los productos farmacéuticos una forma física o de administración particular A61J 3/00; aspectos químicos o utilización de substancias químicas para, la desodorización del aire, la desinfección o la esterilización, vendas, apósitos, almohadillas absorbentes o de los artículos para su realización A61L;   composiciones a base de jabón C11D). › A61K 39/00 Preparaciones medicinales que contienen antígenos o anticuerpos (materiales para ensayos inmunológicos G01N 33/53). › Pasteurella; Haemophilus.
  • C12N1/21 C12N […] › C12N 1/00 Microorganismos, p.ej. protozoos; Composiciones que los contienen (preparaciones de uso médico que contienen material de protozoos, bacterias o virus A61K 35/66, de algas A61K 36/02, de hongos A61K 36/06; preparación de composiciones de uso médico que contienen antígenos o anticuerpos bacterianos, p. ej. vacunas bacterianas, A61K 39/00 ); Procesos de cultivo o conservación de microorganismos, o de composiciones que los contienen; Procesos de preparación o aislamiento de una composición que contiene un microorganismo; Sus medios de cultivo. › modificados por la introducción de material genético extraño.
  • C12N15/70 C12N 15/00 […] › Vectores o sistemas de expresión especialmente adaptados a E. coli.
  • C12N5/10 C12N […] › C12N 5/00 Células no diferenciadas humanas, animales o vegetales, p. ej. líneas celulares; Tejidos; Su cultivo o conservación; Medios de cultivo para este fin (reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00). › Células modificadas por introducción de material genético extraño, p. ej. células transformadas por virus.

Clasificación antigua:

  • A61K39/102 A61K 39/00 […] › Pasteurella; Haemophilus.
  • C12N1/21 C12N 1/00 […] › modificados por la introducción de material genético extraño.
  • C12N15/70 C12N 15/00 […] › Vectores o sistemas de expresión especialmente adaptados a E. coli.
  • C12N5/10 C12N 5/00 […] › Células modificadas por introducción de material genético extraño, p. ej. células transformadas por virus.

Fragmento de la descripción:

Producción de la forma lipidada de las lipoproteínas asociadas a peptidoglicano de bacterias gram-negativas.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a la expresión de la forma lipidada de la proteína asociada a peptidoglicano de bacterias gram-negativas y al uso de esta proteína lipidada recombinante en composiciones antigénicas.

Antecedentes de la invención

Las paredes celulares de las bacterias gram-negativas contienen restos reticulados conocidos como peptidoglicanos. Diversas bacterias gram-negativas producen proteínas que están unidas covalentemente a los peptidoglicanos. Dicha proteína se denomina lipoproteína asociada a peptidoglicano (LAP). Las LAP están presentes como parte del locus tol en diversas bacterias gram-negativas,, incluyendo Legionella pneumophila (entrada a bibliografía 1), Escherichia coli (2), Haemophilus ducreyi (3), Campylobacter jejuni (4), Pseudomonas putida (5), Brucella abortus (6), Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella aerogenes, Serratia marcescens, Proteus vulgaris, Salmonella typhimurium (7) Actinobacillus pleuropneumoniae (8), Helicobacter pylori (9) Chlamydia pneumonia (10), y Chlamydia trachomatis (11).

Otra bacteria que contiene LAP es la bacteria Haemophilus influenzae (H. influenzae). La bacteria H. influenzae se divide en dos grupos. Las cepas que poseen una cápsula conocida se tipifican en función de la reacción serológica de la cápsula con el antisuero de referencia. Se han identificado los tipos a-f. Las cepas que no reaccionan con ninguno de los antisueros de referencia se conocen como no tipificables.

H. influenzae de typo b (Hib) es la causa mas frecuente de la meningitis neonatal y otras infecciones invasoras en los estados Unidos (12). La mayor incidencia de meningitis infantil se produce entre uno y cinco años de edad. El sesenta por ciento de los casos de meningitis causadas por Hib aparecen en niños menores de dos años de edad (12).

H. influenzae no tipificable (NTHi) es un organismo gram-negativo que causa varias enfermedades, incluyendo neumonía, bacteriemia, meningitis, sepsis posparto y traqueo bronquitis febril aguda en adultos (13). Se ha indicado que NTHi causa entre el 20 y el 40 por ciento de todos los casos de otitis media observada en niños pequeños (14, 15, 16). Los niños pueden experimentar infecciones múltiples del mismo organismo puesto que la infección no confiere una inmunidad muy duradera. La terapia actual para las apariciones crónicas o repetitivas de la otitis media incluye la administración de antibióticos y la inserción de tubos para drenar el oído interno. Las cepas de NTHi también se han implicado como una causa primaria de sinusitis (17). Adicionalmente, NTHi causa sepsis neonatal.

Las actuales composiciones antigénicas basadas en cápsulas son ineficaces contra NTHi. Se ha observado que la superficie de estas bacterias es antigénicamente muy variable, siendo particularmente diversas las proteínas, P1 y P2, (18,19) de la membrana principal externa. En seres humanos, la presencia de anticuerpos séricos bactericidas se ha descrito para correlacionarla con protección de otitis media causada por cepas NTHi sensibles (20).

Los candidatos para incluir en las composiciones antigénicas contra NTHi deben conservarse altamente al nivel de aminoácido, tener la superficie expuesta (en particular, proteínas externas de membrana), producir anticuerpos bactericidas y estar presentes en todos los aislados. Investigaciones previas han demostrado que la proteína P6 (también conocida como PBOMP-1 e HiPAL) (21) de NTHi cumple todos estos criterios. Se ha demostrado que las proteínas nativas purificadas provocan anticuerpos bactericidas (22, 23, 24, 25) y se conservan antigénicamente (22, 23, 26, 27).

La evaluación de la secuencia genética del gen P6 ha demostrado que este está muy conservado entre los aislados de NTHi óticos y por tanto la secuencia de la proteína también está muy conservada. La P6 nativa es una lipoproteína, más específicamente una LAP, que se modifica en la cisteína amino-terminal con lípidos. Esta proteína está presente en H. influenzae en cantidades relativamente pequeñas (menos del 1% del total de las proteínas de la membrana externa), haciendo muy difícil la purificación de cantidades útiles a partir del organismo nativo. Por tanto, se necesita una versión de P6 recombinante para el desarrollo adicional como un componente en las composiciones antigénicas.

Varios laboratorios no podían expresar la rP6 lipidada en grandes cantidades en E. coli (28.29). Como resultado, construcciones recombinantes iniciales que expresan P6 en E. coli podían expresar solamente una versión no lipidada de la proteína. Estos grupos indicaron que, aunque la proteína P6 lipidada purificada de H. influenzae era más inmunogénica que la rP6 no lipidada purificada de E. coli, era difícil modificar genéticamente un vector de ADN que expresase la P6 lipidada (28.29); es decir, no mejor que los bajos niveles de la P6 nativa expresada por H. influenzae.

Los intentos previos para expresar la rP6 lipidada se basaron en promotores que no estaban bajo estrecha regulación transcripcional, tal como trc, taq, laca y PL-C1857. El documento WO 90/02557A desvela un plásmido que contiene el promotor lac unido operativamente a una secuencia aislada de ADN que codifica la proteína PBOMP01. Se planteó la teoría de que esta transcripción algo filtrante conduce a efectos sutiles sobre E. coli lo que contribuye a niveles bajos de expresión de la proteína lipidada. La evidencia experimental indica que la capacidad de la peptidasa II de señal para añadir lípidos al extremo N de la proteína no era responsable del bajo rendimiento de la P6 procesada (datos no demostrados).

Aunque la proteína P6 de H. influenzae han sido un candidato primario para la inclusión en las composiciones antigénicas contra la enfermedad de Haemophilus (20, 23, 24, 25, 30, 31), las cantidades relativamente pequeñas disponibles de H. influenzae han hecho esencial la expresión recombinante de esta proteína. Los esfuerzos previos para expresar la proteína P6 lipidada en cantidades significativas han fracasado (28, 29). Por tanto, los investigadores se han centrado en la expresión y purificación de formas múltiples de la P6 no lipidada.

La respuesta del anticuerpo engendrada por la rP6 no lipidada era biológicamente funcional, capaz de proteger a ratas recién nacidas de la meningitis (28) y de provocar anticuerpos bactericidas (28, 29), pero de una magnitud más baja que los provocados por la P6 nativa no lipidada (28).

Por lo tanto, hay una necesidad de construir sistemas de vectores de expresión célula-huésped que expresen LAP lipidadas de bacterias gram-negativas. En particular, hay una necesidad de construir sistemas de vectores de expresión célula-huésped que expresen la rP6 lipidada, que se puedan después incluir en composiciones antigénicas contra H. influenzae.

Resumen de la invención

Por tanto, es un objeto de la invención desarrollar construcciones genéticas capaces de expresar las LAP de bacterias gram-negativas en células huéspedes bacterianas.

Es un objeto particular de esta invención desarrollar construcciones genéticas capaces de expresarse en E. coli.

Otro objeto adicional de esta invención es incluir esta rP6 lipidada en composiciones antigénicas para administrar a un mamífero para evitar la enfermedad causada por H. influenzae.

Estos y otros objetos de la invención como se describe a continuación se consiguen por clonación y expresión en células bacterianas de las formas lipidadas de las PAL mediante el uso de promotores estrechamente regulados en los vectores de expresión. Por consiguiente, la presente invención proporciona un plásmido como se define en las reivindicaciones.

La invención se ejemplifica por la clonación y expresión en células bacterianas de la forma lipidada de la proteína P6 recombinante de H. influenzae mediante el uso de dichos promotores en el vector de la expresión.

Específicamente, para la expresión de la P6 recombinante lipidada, se construyen plásmidos que contienen un promotor de arabinosa inducible o un promotor T7, en el que el promotor está unido operativamente a una secuencia aislada y purificada de ADN que comprende una secuencia de ADN que codifica la proteína P6, y en el que la secuencia de...

 


Reivindicaciones:

1. Un plásmido que contiene un promotor estrechamente regulado, en el que dicho promotor está unido operativamente a una secuencia de ADN aislada y purificada que codifica una lipoproteína asociada a un peptidoglicano (LAP) de bacterias gram-negativas, en el que el promotor es un promotor inducible por arabinosa o un promotor T7.

2. El plásmido de la Reivindicación 1 en el que la LAP es la proteína P6 de Haemophilus influenzae (H. influenzae).

3. El plásmido de la Reivindicación 2 en el que el plásmido se denomina pPX4020 o pPX4019 como se especifica en la Fig. 1.

4. Una célula huésped bacteriana transformada, transducida o transfectada con el plásmido de la Reivindicación 1.

5. Un procedimiento para producir una LAP lipidada recombinante, que comprende transformar, transducir o transfectar una célula huésped bacteriana con el plásmido de la Reivindicación 1 y cultivar la célula huésped en condiciones que permitan la expresión de dicha LAP recombinante en forma lipidada por la célula huésped.

6. El procedimiento de la Reivindicación 5 en el que la LAP es proteína P6 de H. influenzae.

7. El procedimiento de la Reivindicación 5 en el que la LAP se usa en la preparación de composiciones antigénicas para conferir protección a mamíferos contra enfermedades causadas por las bacterias correspondientes

8. El procedimiento de la Reivindicación 7 en el que la enfermedad está causada por H. influenzae.

9. El uso un plásmido de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 1-3 en la fabricación de una composición antigénica que comprende una LAP lipidada recombinante, en la que dicha composición antigénica provoca una respuesta inmune protectora en un huésped mamífero.

10. El uso de la Reivindicación 9 en que la LAP es la proteína P6 de H. influenzae.

11. El uso de la Reivindicación 9 que adicionalmente comprende uno o más de un diluyente o portador.

12. El uso de la Reivindicación 9 que adicionalmente comprende al menos un adyuvante.

13. El uso de la Reivindicación 12, en la que el adyuvante se selecciona del grupo constituido al menos por hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, Stimulon TM QS-21, monofosforil lipido A 3-O-desacetilado, IL-12, toxina termoestable de E.coli, y la toxina del cólera de tipo silvestre o mutante.


 

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