Un vector que comprende un polinucleótido aislado, comprendiendo dicho polinucleótido:

a. una isla CpG libre de metilación extendida que engloba promotores duales divergentemente transcritos;

b. un ácido nucleico expresable terminado por una señal de poliadenilación;

c. un gen de marcador de selección operativamente ligado a un promotor;

caracterizado porque el vector puede linealizarse e integrarse en un cromosoma de forma que tanto la isla CpG como el marcador de selección están operativamente ligados al ácido nucleico expresable, y los componentes están situados en el orden: isla CpG libre de metilación extendida, ácido nucleico expresable, gen de marcador de selección, en la orientación 5'' a 3'' con respecto a la cadena de transcripción del ácido nucleico expresable, y la señal de poliadenilación en el extremo 3'' del ácido nucleico expresable está dentro de 2000 pb del extremo proximal del marcador de selección

Expresión de genes mejorada.

Ámbito de la invención

La presente invención se refiere a un polinucleótido que comprende un elemento de apertura de cromatina ubicuo (UCOE) junto con un elemento de marcador de selección. Cuando está operativamente ligado a y flanqueando una secuencia de ácidos nucleicos expresable, la combinación de elementos proporciona niveles altos y reproducibles de expresión de genes. La presente invención también se refiere a un vector que comprende la secuencia de polinucleótidos, una célula huésped que comprende el vector y al uso del polinucleótido, vector o célula huésped en terapia, o para aplicaciones que implican la expresión de proteínas en cultivo celular.

Antecedentes de la invención

El presente modelo de estructura de cromatina en eucariotas superiores postula que los genes están organizados en "dominios" (Dillon, N. & Grosveld, F. Chromatin domains as potential units of eukaryotic gene function. Curr. Opin. Genet. Dev. 4, 260-264 (1994); Higgs, D.R. Do LCRs open chromatin domains? Cell 95, 299-302 (1998)). Se prevé que los dominios de cromatina existan en o bien un estado condensado "cerrado" transcripcionalmente silencioso o en una configuración descondensada "abierta" y transcripcionalmente competente. El establecimiento de una estructura de cromatina abierta caracterizada por un aumento de la sensibilidad a DNasal, hipometilación de ADN e hiperacetilación de histonas se considera un requisito previo para el comienzo de la expresión de genes.

La naturaleza abierta y cerrada de las regiones de cromatina se refleja en el comportamiento de los transgenes que están aleatoriamente integrados en el genoma de células huésped. Constructos idénticos dan diferentes modelos de expresión específica de tejido y específica de fase de desarrollo cuando se integran en diferentes localizaciones en el genoma de ratón (Palmiter, R.D. Se Brinster, R.L. Ann. Ref Genet. 20, 465-499 (1986); Allen, N.D. y col. Nature 333, 852-855 (1988); Bonnerot, C., Grimber, G., Briand, P. & Nicolás, J.F. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6331-6335 (1990)).

Frecuentemente también se observa un modelo de expresión variegado dentro de un tejido de ratón transgénico dado conocido como variegación por efecto de posición (PEV) (Kioussis, D. & Festenstein, R. Curr. Opin. Genet. Dev. 7, 614-619 (1997)). Cuando los genes exógenos están integrados en el cromosoma de cultivos de células de mamífero in vitro, muchos de los acontecimientos de integración dan como resultado el rápido silenciamiento del transgén y el resto da una gran variabilidad en los niveles de expresión (Pikaart, M.J., Recillas-Targa, F. & Felsenfield, G. Genes Dev. 12, 2852-2862 (1998); Fussenegger, M., Bailey, J.E., Hauser, H. & Mueller, P.P Trends Biotech. 17, 35-42 (1999)). Estos efectos de posición hacen ineficaz la expresión de transgenes con implicaciones para aplicaciones de tanto investigación básica como de biotecnología.

El modelo de dominios de cromatina de la organización de genes sugiere que los elementos de control genético que pueden establecer y mantener una estructura de cromatina abierta transcripcionalmente competente deben asociarse a regiones activas del genoma.

Las regiones de control de locus (LCR) son una clase de elementos reguladores de la transcripción con capacidad de remodelación de la cromatina de largo alcance. Las LCR se definen funcionalmente en ratones transgénicos por su capacidad para conferir niveles fisiológicos independientes del sitio de integración, dependientes del número de copias de transgenes de expresión en un gen ligado en cis, especialmente transgenes de copia única, Fraser, P. & Grosveld, F. Curr. Opin. Cell Biol. 10, 361-365 (1998); Li, Q., Harju, S. & Peterson, K.R. Trends Genet. 15: 403-408 (1999). De forma crucial, tal expresión es específica de tejido. Las LCR pueden obstruir la propagación de heterocromatina, evitar el PEV (Kioussis, D. & Festenstein, R. Curr. Opin. Genet. Dev. 7, 614-619 (1997)) y estar constituidas por una serie de sitios hipersensibles (HS) a DNasal que puede localizarse bien en 5' ó 3' de los genes que regulan (Li, Q., Harju, S. & Peterson, K.R. Trends Genet. 15: 403-408 (1999)).

Las LCR parecer estar comprendidas por dos componentes separados, aunque no necesariamente independientes. Primero, el establecimiento de un "dominio de cromatina abierto" y segundo una capacidad de activación transcripcional dominante para conferir una expresión dependiente del número de copias de transgenes (Fraser, P. & Grosveld, F. Curr. Opin. Cell Biol. 10, 361-365 (1998). Los mecanismos moleculares mediante los que las LCR ejercen su función sigue siendo un punto de discrepancia (Higgs, D.R. Cell 95, 299-302 (1998); Bulger, M. & Groudine, M. Genes Dev. 13, 2465-2477 (1999); Grosveld, F. Curr. Opin. Genet. Dev. 9 152-157 (1999); Bender, M.A., Bulger, M., Close, J. & Groudine, M. Mol. Cell 5, 387-393 (2000).

La generación de líneas celulares de mamífero cultivadas que producen altos niveles de un producto proteínico terapéutico es una aplicación en desarrollo importante. Los efectos de posición de la cromatina hacen que sea un procedimiento difícil, que requiere mucho tiempo y caro. La solución más comúnmente usada para la producción de tales "fábricas de células" de mamífero se basa en la amplificación génica inducida por una combinación de un gen de resistencia a fármacos (por ejemplo, DHFR, glutamina sintetasa (Kaufman RJ. Methods Enzymol 185, 537-566 (1990)) y el mantenimiento de presión selectiva reducida. El uso de vectores que contienen LCR de dominios de genes sumamente expresados usando células derivadas del tejido apropiado simplifica mucho el procedimiento dando una gran proporción de líneas celulares clónicas que muestran niveles de expresión altos estables (Needham M, Gooding C, Hudson K, Antoniou M, Grosfeld F y Hollis M. Nucleic Acids Res 20, 997-1003 (1992); Needham M, Egerton M, Millest A, Evans S, Popplewell M, Cerillo G, McPheat J, Monk A, Jack A, Johnstone D y Hollis M. Protein Expr Purif 6,124-131 (1995).

Sin embargo, la especificidad de tejido de LCR, aunque es útil en algunas circunstancias, también es una gran limitación para muchas aplicaciones, por ejemplo, cuando no se conoce ninguna LCR para el tejido en el que se requiere la expresión, o cuando se requiere la expresión en muchos o todos los tejidos.

Las solicitudes de patente en tramitación junto con la presente PCT/GB99/02357 (documento WO 00/05393), US 09/358082, GB 0022995.5 y US 60/252.048 de los inventores incorporadas por referencia en este documento describen elementos que son responsables, en su contexto cromosómico natural, de establecer una estructura de cromatina abierta a través de un locus que está constituido exclusivamente por genes de mantenimiento expresados ubicuamente. Estos elementos no se derivan de una LCR y comprenden islas CpG libres de metilación extendidas. Los inventores han usado el término elemento de apertura de cromatina ubicuo (UCOE) para describir tales elementos.

En ADN de mamífero, el dinucleótido CpG es reconocido por una enzima ADN metiltransferasa que metila la citosina en 5-metilcitosina. Sin embargo, la 5-metilcitosina es inestable y se convierte en timina. Como resultado, los dinucleótidos CpG se producen mucho menos frecuentemente frecuentemente que lo que se esperaría por casualidad. Sin embargo, algunas secciones de ADN genómico tienen una frecuencia de CpG que es más próxima a la esperada y estas secuencias se conocen como "islas CpG". Como se usa en este documento, una "isla CpG" se define como una secuencia de ADN de al menos 200 pb que tiene un contenido de GC de al menos el 50% y una relación de contenido de CpG observada/esperada de al menos 0,6 (es decir, un contenido de dinucleótido CpG de al menos el 60% del que se esperaría por casualidad) (Gardiner-Green M y Frommer M. J Mol Biol 196, 261-282 (1987); Rice P, Longden I y Bleasby A Trends Genet 16, 276-277 (2000).

Las islas CpG libres de metilación son muy conocidas en la técnica (Bird y col. (1985) Cell 40: 91-99, Tazi y Bird (1990) Cell 60: 909-920) y pueden definirse como islas CpG en las que una proporción sustancial de los residuos de citosina no están metilados y que normalmente se extienden por los extremos 5' de dos genes divergentemente transcritos poco espaciados (0,1-3 kb). Se presenta que estas regiones de ADM permanecen hipometiladas en todos los tejidos durante todo el desarrollo (Wise y Pravtcheva (1999) Genomics 60: 258-271). Frecuentemente están asociadas a los extremos 5' de genes ubicuamente expresados, mostrando además...

1. Un vector que comprende un polinucleótido aislado, comprendiendo dicho polinucleótido:

caracterizado porque el vector puede linealizarse e integrarse en un cromosoma de forma que tanto la isla CpG como el marcador de selección están operativamente ligados al ácido nucleico expresable, y los componentes están situados en el orden: isla CpG libre de metilación extendida, ácido nucleico expresable, gen de marcador de selección, en la orientación 5' a 3' con respecto a la cadena de transcripción del ácido nucleico expresable, y la señal de poliadenilación en el extremo 3' del ácido nucleico expresable está dentro de 2000 pb del extremo proximal del marcador de selección.

2. El vector de la reivindicación 1, en el que la señal de poliadenilación en el extremo 3' del ácido nucleico expresable está dentro de 1500 pb del extremo proximal del marcador de selección.

3. El vector de la reivindicación 2, en el que la señal de poliadenilación en el extremo 3' del ácido nucleico expresable está dentro de 1000 pb del extremo proximal del marcador de selección.

4. El vector de la reivindicación 3, en el que la señal de poliadenilación en el extremo 3' del ácido nucleico expresable está dentro de 500 pb del extremo proximal del marcador de selección.

5. El vector de cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que el marcador de selección es un gen de resistencia a antibióticos.

6. El vector de la reivindicación 5, en el que el gen de resistencia a antibióticos se obtiene de una especie de Streptomyces.

7. El vector de la reivindicación 5, en el que el gen de resistencia a antibióticos se selecciona del grupo que está constituido por: un gen de resistencia a puromicina; un gen de resistencia a neomicina; un gen de resistencia a higromicina; un gen de resistencia a bleomicina o un gen de resistencia a blasticidina.

8. El vector de la reivindicación 7, en el que el gen de resistencia a puromicina es el gen de puromicina N-acetiltransferasa de Streptomyces alboniger, opcionalmente un gen de puromicina M-acetiltransferasa modificado de Streptomyces alboniger.

9. El vector de la reivindicación 7, en el que el gen de resistencia a neomicina es el gen de aminoglucósido fosfotransferasa de Streptomyces fradiae.

10. El vector de la reivindicación 7, en el que el gen de resistencia a higromicina es el gen de higromicina fosfotransferasa de Streptomyces hygroscopicus.

11. El vector de la reivindicación 7, en el que el gen de resistencia a bleomicina es la proteína de unión a bleomicina de Streptomyces verticillus, opcionalmente la bleomicina N-acetiltransferasa de Streptomyces verticillus.

12. El vector de la reivindicación 7, en el que el gen de resistencia a blasticidina es el gen de blasticidina S-acetiltransferasa de Streptomyces verticillum.

13. El vector según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el marcador de selección es el gen de resistencia a antibióticos aminociclitol fosfotransferasa de Escherichia coli.

14. El vector según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el marcador de selección es el gen de resistencia a antibióticos neomicina fosfotransferasa del transposón Tn5.

15. El vector de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la isla CpG libre de metilación extendida comprende un fragmento de ADN de 8 kb que abarca el gen A2/B1 de ribonucleoproteína nuclear heterogénea humana.

16. El vector de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que la isla CpG libre de metilación extendida comprende un fragmento de ADN de 8 kb que abarca el gen A2/B1 de ribonucleoproteína nuclear heterogénea murina.

17. El vector de la reivindicación 16, en el que la isla CpG libre de metilación extendida comprende los nucleótidos 1-7898 de la secuencia de la Figura 19.

18. El vector de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que la isla CpG libre de metilación extendida comprende un fragmento de ADN de 2,0 kb que abarca la isla CpG de ß-actina humana/región promotora y un fragmento de ADN de 1,8 kb que abarca la isla CpG de PDCD2 humano/región promotora.

19. El vector de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el ácido nucleico expresable es un ácido nucleico terapéutico.

20. El vector de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el ácido nucleico expresable codifica una proteína recombinante para la expresión en un sistema de cultivo celular in vitro.

21. El vector de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el ácido nucleico expresable está contenido dentro de un sitio de clonación múltiple y el sitio de clonación múltiple está adicionalmente operativamente ligado a un promotor.

22. El vector de la reivindicación 21, en el que dicho promotor es un promotor inmediato/temprano de CMV.

23 . El vector de la reivindicación 1 que comprende los nucleótidos 1-10551 de la secuencia de la Figura 10.

24. El vector de la reivindicación 1 que comprende los nucleótidos 1-13545 de la secuencia de la Figura 12.

25. El vector de la reivindicación 24, en el que el gen de resistencia a puromicina está cambiado por el gen de aminoglucósido fosfotransferasa de Streptomyces fradiae que tiene la secuencia de la Figura 15.

26. El vector de la reivindicación 24, en el que el gen de resistencia a puromicina está cambiado por el gen de aminociclitol fosfotransferasa de Escherichia coli que tiene la secuencia de la Figura 17.

27. El vector de la reivindicación 24, en el que el gen de resistencia a puromicina está cambiado por una forma modificada del gen de puromicina N-acetiltransferasa de Streptomyces alboniger que tiene la secuencia de la Figura 14.

28. El vector de la reivindicación 24, en el que el promotor de CMV IE humano está cambiado por el promotor de CMV IE murino.

29. El vector de la reivindicación 24, en el que la isla CpG libre de metilación extendida que comprende un fragmento de 8 kb que abarca el gen A2B de ribonucleoproteína nuclear heterogénea humana está cambiado por la isla CpG libre de metilación extendida que comprende un fragmento de 8 kb que abarca el gen A2/B1 de ribonucleoproteína nuclear heterogénea murina que tiene la secuencia de la Figura 19.

30. El vector de la reivindicación 1 que comprende los nucleótidos 1-12039 de la secuencia de la Figura 21.

31. El vector de la reivindicación 1 que comprende los nucleótidos 1-11646 de la secuencia de la Figura 23.

32. El vector de la reivindicación 1 que comprende los nucleótidos 1-9027 de la secuencia de la Figura 25.

33. El vector de la reivindicación 1 que comprende los nucleótidos 1-12221 de la secuencia de la Figura 27.

34. El vector de la reivindicación 1 que comprende los nucleótidos 1-11828 de la secuencia de la Figura 29.

35. El vector de la reivindicación 1 que comprende los nucleótidos 1-9209 de la secuencia de la Figura 31.

36. Una célula huésped transfectada con el vector de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 35.

37. Uso del vector de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 35 o la célula huésped de la reivindicación 36 para obtener la expresión de un ácido nucleico expresable.

38. Uso del vector de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 35 o la célula huésped de la reivindicación 36 en un sistema de cultivo celular para obtener la expresión de un producto génico deseado.

39. El vector de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 35 o la célula huésped de la reivindicación 36 para uso como medicamento.

40. El vector de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 35 o la célula huésped de la reivindicación 36 para uso en terapia génica.

41. Uso del vector de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 35 o la célula huésped de la reivindicación 36 para la preparación de un medicamento para una enfermedad tratable por terapia génica.

42. Una composición farmacéutica que comprende el vector de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 35 o la célula huésped de la reivindicación 36 en combinación con un excipiente farmacéuticamente aceptable.