EPITOPES DE LAS CELULAS T ADYUVANTES.

Un epítope de las células T adyuvantes capaz de inducir una respuesta inmunitaria en un animal canino,

estando contenido el epítope dentro de una secuencia peptídica seleccionada del grupo constituido por SSKTQTHTQQ DRPPQPS (SEQ ID NO: 1); QPSTELEETRTSRARHS (SEQ ID NO: 2); RHSTTSAQRSTHYDPRT (SEQ ID NO: 3); PRTSDRPVSYTMNRTRS (SEQ ID NO: 4); TRSRKQTSHRLKNIPVH (SEQ ID NO: 5); SHQYLVIKLIPNAS LIE (SEQ ID NO: 6); IGTDNVHYKIMTRPSHQ (SEQ ID NO: 7); YKIMTRPSHQYLVIKLI (SEQ ID NO: 8); KLIPNASLIENCTKAEL (SEQ ID NO: 9); AELGEYEKLLNSVLEPI (SEQ ID NO: 10); EPINQALTLMTKNVK PL (SEQ ID NO: 12); FAGVVLAGVALGVATAA (SEQ ID NO: 13); TAAQITAGIALHQSNLN (SEQ ID NO: 15); GIALHQSNLNAQAIQSL (SEQ ID NO: 16); NLNAQAIQSLRTSLEQS (SEQ ID NO: 17); QSLRTSLEQSNKAIEEI (SEQ ID NO: 18); EQSNKAIEEIREATQET (SEQ ID NO: 19); TELLSIFGPSLRDPISA (SEQ ID NO: 20); PR YIATNGYLISNFDES (SEQ ID NO: 21); CIRGDTSSCARTLVSGT (SEQ ID NO: 22); DESSCVFVSESAICSQN (SEQ ID NO: 23); TSTIINQSPDKLLTFIA (SEQ ID NO: 24) y SPDKLLTFIASDTCPLV (SEQ ID NO: 25)

Epítopes de las células T adyuvantes.

La presente invención se refiere a epítopes de las células T adyuvantes derivados del Virus del Moquillo de los caninos (CDV). La presente invención se refiere a composiciones que incluyen al menos un epítope de las células T adyuvantes y opcionalmente epítopes de las células B y/o epítopes CTL.

Antecedentes de la invención

Para que cualquier péptido sea capaz de inducir una respuesta eficaz de anticuerpos, el mismo tiene que contener secuencias particulares de aminoácidos conocidas como epítopes que son reconocidas por el sistema inmunitario. En particular, para las respuestas de anticuerpos, los epítopes precisan ser reconocidos por receptores específicos de inmunoglobulinas (Ig) presentes en la superficie de los linfocitos B. Son estas células las que se diferencian finalmente en células plasmáticas capaces de producir anticuerpos específicos para dicho epítope. Además de estos epítopes de las células B, el inmunógeno debe contener también epítopes que son presentados por las células presentadoras de antígeno (APC) a receptores específicos presentes en los linfocitos T adyuvantes, las células que son necesarias para proporcionar las señales requeridas para que las células B se diferencien en células productoras de anticuerpos.

En el caso de las infecciones virales y en muchos casos de cáncer, el anticuerpo produce un beneficio limitado en la recuperación y el sistema inmunitario responde con células T citotóxicas (CTL) que son capaces de destruir la célula infectada por el virus o célula cancerosa. Al igual que las células T adyuvantes, las CTL son activadas en primer lugar por interacción con APC que llevan su epítope peptídico específico presentado en la superficie, esta vez en asociación con el MHC clase I en lugar de moléculas de la clase II. Una vez activadas, las CTL pueden capturar una célula diana que lleva el mismo complejo péptido/clase I y causar su lisis. Está evidenciándose también que las células T adyuvantes juegan un papel en este proceso; antes que la APC sea capaz de activar la CTL, la misma tiene que recibir primeramente señales de la célula adyuvante T para regular en sentido creciente la expresión de las moléculas coestimuladoras necesarias.

Los epítopes de las células T adyuvantes son fijados por moléculas presentes en la superficie de las APCs que están codificadas por genes de clase II del complejo principal de histocompatibilidad (MHC). El complejo de la molécula de clase II y el epítope peptídico es reconocido luego por receptores específicos de las células T (TCR) en la superficie de los linfocitos T adyuvantes. De este modo la célula T, presentada con un epítope antigénico en el contexto de una molécula MHC, puede activarse y proporcionar las señales necesarias para que el linfocito B se diferencie. Tradicionalmente, la fuente de epítopes de las células T adyuvantes para un inmunógeno peptídico es una proteína portadora a la cual se acoplan péptidos de modo covalente, pero este procedimiento de acoplamiento puede introducir otros problemas tales como modificación del determinante antigénico durante el proceso de acoplamiento y la inducción de anticuerpos contra el vehículo a expensas de anticuerpos que se dirigen hacia el péptido (Schutze, M. P., Leclerc, C. Jolivet, M. Audibert, F. Chedid, L. Carrier-induced epitopic suppression, a major issue for future synthetic vaccines. Immunol. 1985, 135, 2319-2322; DiJohn, D., Torrese, J. R. Murillo, J. Herrington, D.A. et al. Effect of priming with carrier on response to conjugate vaccine. The Lancet. 1989, 2, 1415-1416). Adicionalmente, el uso de proteínas irrelevantes en la preparación introduce problemas de control de calidad. La elección de proteínas portadoras apropiadas es muy importante en el diseño de vacunas peptídicas y su selección está limitada por factores tales como toxicidad y factibilidad de su producción en gran escala. Existen otras limitaciones a este enfoque, que incluyen el tamaño de la carga peptídica que puede acoplarse y la dosis de vehículo que puede ser administrada en condiciones de seguridad (Audibert, F. a. C., L. 1984. Modern approaches to vaccines. Molecular and chemical basis of virus virulence and immunogenicity., Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York.). Aunque las moléculas portadoras permiten la inducción de una respuesta inmunitaria fuerte, las mismas están asociadas también con efectos indeseables tales como la supresión de la respuesta de anticuerpos anti-peptídicos (Herzenberg, L. A. y Tokuhisa, T. 1980. Carrier-priming leads to hapten-specific suppression. Nature 285:664; Schutze, M. P., Leclerc, C., Jolivet, M., Audibert, F., y Chedid, L. 1985. Carrier-induced epitopic suppression, a major issue for future synthetic vaccines. J Immunol 135:2319; Etlinger, H. M., Felix, A. M., Gillessen, D., Heimer, E. P., Just, M., Pink, J. R., Sinigaglia, F., Sturchler, D., Takacs, B., Trzeciak, A., and et al. 1988. Assessment in humans of a synthetic peptide-based vaccine against the sporozoite stage of the human malaria parasite, Plasmodium falciparum. J Immunol 140:626).

En general, por tanto, un inmunógeno ha de contener epítopes capaces de ser reconocidos por las células T adyuvantes además de los epítopes que serán reconocidos por la Ig de la superficie o por los receptores presentes en las células T citotóxicas. Debe tenerse en cuenta que estos tipos de epítopes pueden ser muy diferentes. Para los epítopes de las células B, la conformación es importante, dado que el receptor de las células B se fija directamente al inmunógeno nativo. En contraste, los epítopes recogidos por las células T no son dependientes de la integridad estructural del epítope, y están constituidos por secuencias cortas de aproximadamente 9 aminoácidos para CTL y secuencias ligeramente más largas, con menor restricción de longitud, para las células T adyuvantes. Los únicos requisitos para estos epítopes son que los mismos puedan alojarse en la hendidura de fijación de la molécula de la clase I o clase II respectivamente, y que el complejo sea capaz luego de acoplarse al receptor de las células T. El sitio de fijación de la molécula de clase II está abierto en ambos extremos, permitiendo una variación mucho mayor en la longitud de los péptidos enlazados (Brown, J. H., T. S. Jardetzky, J. C. Gorga, L. J. Stern, R. G. Urban, J. L. Strominger y D. C. Wiley, 1993. Three-dimensional structure of the human class II histocompatibility antigen HLA-DR1. Nature 364:33) with epitopes as short as 8 amino acid residues being reported (Fahrer, A.M., Geysen, H.M., White, D.O., Jackson. D.C. y Brown, L.E. Analysis of the requirements for class II-restricted T-cell recognition of a single determinant reveals considerable diversity in the T-cell response and degeneracy of peptide binding to I-Ed J. Immunol. 1995. 155: 2849-2857).

El virus del moquillo de los caninos (CDV) pertenece al subgrupo de la familia de morbilivirus o paramixovirus de los virus de RNA de cadena negativa. Otros virus que son miembros de este grupo son el virus del sarampión y el virus rinderpest ("morriña") de la peste del ganado. El desarrollo de vacunas basadas en péptidos ha despertado un interés considerable en la identificación de epítopes de las células B y T a partir de secuencias de proteínas. La base racional para la utilización de epítopes de las células T a partir de proteínas tales como la proteína F del CDV es que se inoculan perros jóvenes contra CDV en la primera fase de su vida y llegarán a poseer por tanto células T adyuvantes específicas para los epítopes de las células T adyuvantes presentes en esta proteína. La exposición subsiguiente a una vacuna que contiene uno o más de los epítopes dará por consiguiente como resultado el reclutamiento de células T adyuvantes existentes y por consiguiente una respuesta inmunitaria incrementada. Tales epítopes de células T adyuvantes podrían, sin embargo, administrarse a animales no sensibilizados e inducir todavía una respuesta inmunitaria. Los autores de la presente invención se propusieron identificar epítopes de las células T de los caninos a partir de la secuencia de la proteína de fusión CDV a fin de que estos epítopes puedan utilizarse luego en el diseño de vacunas basadas en péptidos, en particular, para los caninos y especies afines.

La LHRH (hormona liberadora de la hormona luteinizante) es una hormona peptídica de 10 aminoácidos de longitud cuya secuencia está conservada entre los mamíferos. La misma es secretada por el hipotálamo y controla la fisiología reproductora tanto de los machos como de las hembras. El principio del desarrollo de vacunas inmunoanticonceptivas...

1. Un epítope de las células T adyuvantes capaz de inducir una respuesta inmunitaria en un animal canino, estando contenido el epítope dentro de una secuencia peptídica seleccionada del grupo constituido por SSKTQTHTQQ DRPPQPS (SEQ ID NO: 1); QPSTELEETRTSRARHS (SEQ ID NO: 2); RHSTTSAQRSTHYDPRT (SEQ ID NO: 3); PRTSDRPVSYTMNRTRS (SEQ ID NO: 4); TRSRKQTSHRLKNIPVH (SEQ ID NO: 5); SHQYLVIKLIPNAS LIE (SEQ ID NO: 6); IGTDNVHYKIMTRPSHQ (SEQ ID NO: 7); YKIMTRPSHQYLVIKLI (SEQ ID NO: 8); KLIPNASLIENCTKAEL (SEQ ID NO: 9); AELGEYEKLLNSVLEPI (SEQ ID NO: 10); EPINQALTLMTKNVK PL (SEQ ID NO: 12); FAGVVLAGVALGVATAA (SEQ ID NO: 13); TAAQITAGIALHQSNLN (SEQ ID NO: 15); GIALHQSNLNAQAIQSL (SEQ ID NO: 16); NLNAQAIQSLRTSLEQS (SEQ ID NO: 17); QSLRTSLEQSNKAIEEI (SEQ ID NO: 18); EQSNKAIEEIREATQET (SEQ ID NO: 19); TELLSIFGPSLRDPISA (SEQ ID NO: 20); PR YIATNGYLISNFDES (SEQ ID NO: 21); CIRGDTSSCARTLVSGT (SEQ ID NO: 22); DESSCVFVSESAICSQN (SEQ ID NO: 23); TSTIINQSPDKLLTFIA (SEQ ID NO: 24) y SPDKLLTFIASDTCPLV (SEQ ID NO: 25).

2. El epítope adyuvante T de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el epítope está contenido dentro de una secuencia peptídica seleccionada del grupo constituido por SSKTQTHTQQDRPPQPS (SEQ. ID NO: 1); QPSELEETR TSRARHS (SEQ. ID NO: 2); RHSTTSAQRSTHYDPRT (SEQ. ID. NO: 3); TRSRKQTSHRLKNIPVH (SEQ. ID. NO: 5); SHQYLVIKLIPNASLIE (SEQ. ID. NO: 6); KLIPNASLIENCTKAEL (SEQ. ID. NO: 9); AELGEYEK LLNSVLEPI (SEQ. ID. NO: 10); EPINQALTLMTKNVKPL (SEQ. ID. NO: 12); TAAQITAGIALHQSNLN (SEQ. ID. NO: 15); GIALHQSNLNAQAIQSL (SEQ. ID. NO: 16); NLNAQAIQSLRTSLEQS (SEQ. ID. NO: 17); QSLRTS LEQSNKAIEEI (SEQ. ID. NO: 18); TELLSIFGPSLRDPISA (SEQ. ID. NO: 20); PRYIATNGYLISNFDES (SEQ. ID. NO: 21); CIRGDTSSCARTLVSGT (SEQ. ID. NO: 22); DESSCVFVSESAICSQN (SEQ. ID. NO: 23); TSTIIN QSPDKLLTFIA (SEQ. ID. NO: 24) y SPDKLLTFIASDTCPLV (SEQ. ID. NO: 25).

3. El epítope de células T adyuvantes de la reivindicación 1 ó 2, en donde el epítope es de una proteína de fusión del virus del moquillo de los caninos (CDV-F).

4. El epítope de las células T adyuvantes de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para uso en la producción de una respuesta inmunitaria en un animal.

5. Una composición para uso en la producción de una respuesta inmunitaria en un animal, comprendiendo la composición un epítope de células T adyuvantes de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, y un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.

6. Una composición para uso en la producción de una respuesta inmunitaria en un animal, comprendiendo la composición una pluralidad de epítopes de las células T adyuvantes de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable, en donde dicha pluralidad de epítopes de las células T adyuvantes están combinados o enlazados entre sí contiguamente para formar un solo polipéptido sin estar distanciados por aminoácidos adicionales.

7. La composición de acuerdo con la reivindicación 6, en donde la pluralidad de los epítopes de las células T adyuvantes están combinados.

8. La composición de acuerdo con la reivindicación 6, en donde la pluralidad de los epítopes de las células T adyuvantes están enlazados entre sí contiguamente para formar un solo polipéptido sin estar distanciados por aminoácidos adicionales.

9. La composición de acuerdo con la reivindicación 5, en donde la composición comprende adicionalmente al menos un péptido epitópico de células B y/o al menos un péptido epitópico CTL combinado con el epítope de las células T adyuvantes o enlazado contiguamente al epítope de las células T adyuvantes para formar un solo polipéptido sin estar distanciados por aminoácidos adicionales.

10. La composición de acuerdo con la reivindicación 7, en donde la composición comprende adicionalmente al menos un péptido epitópico de las células B y/o al menos un péptido epitópico CTL y en donde al menos un péptido epitópico de las células B y/o al menos un péptido epitópico CTL está combinado con una pluralidad de los epítopes de las células T adyuvantes o enlazado contiguamente a una pluralidad de los epítopes de las células T adyuvantes para formar un solo polipéptido sin estar distanciados por aminoácidos adicionales.

11. La composición de acuerdo con la reivindicación 8, en donde la composición comprende adicionalmente al menos un péptido epitópico de las células B y/o al menos un péptido epitópico CTL y en donde al menos un péptido epitópico de las células B y/o al menos un péptido epitópico CTL está combinado con el polipéptido único formado por una pluralidad de los epítopes de las células adyuvantes T o enlazado contiguamente al polipéptido único formado por una pluralidad de los epítopes de las células T adyuvantes sin estar distanciados por aminoácidos adicionales.

12. La composición de acuerdo con la reivindicación 9 ó 11, en donde el al menos un péptido epitópico de las células B y/o el al menos un péptido epitópico CTL está/están enlazado(s) continuamente a un epítope de las células T adyuvantes para formar un solo polipéptido sin estar distanciados por aminoácidos adicionales.

13. La composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, en donde el epítope de las células B es un epítope de las células B de la hormona liberadora de la hormona luteinizante (LHRH).

14. La composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 13, en donde la composición comprende un adyuvante.

15. La composición de acuerdo con la reivindicación 14, en donde el adyuvante comprende ISCOMs o Iscomatrix.

16. Uso del epítope de las células T adyuvantes de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en la preparación de una composición para inducir una respuesta inmunitaria en un animal.