Un método de alto rendimiento para determinar la actividad de una enzima fosfolipasa asociada a lipoproteína A2 (Lp-PLA2) en un conjunto de muestras que comprende las etapas de;

(i) preparar una solución que comprende factor de activación de plaquetas (PAF) marcado;

(ii) tomar alícuotas de cada una de las muestras del conjunto en un pocillo de una placa de microtítulo o tubo de microcentrífuga;

(iii) poner en contacto cada una de las muestras de tejido del conjunto con la solución de la etapa de preparación;

(iv) poner en contacto cada una de las soluciones de la primera etapa de contacto con una molécula secuestrante de PAF para formar un complejo molecular secuestrante de PAF;

(v) poner en contacto dicho complejo molecular secuestrante de PAF con una solución de precipitación que comprende ácido tricloroacético (TCA) para formar un precipitado y un sobrenadante;

(vi) eliminar dicho complejo molecular secuestrante de PAF centrifugando dicha placa de microtítulo o tubo de microcentrífuga a al menos 6.000 g durante al menos 5 minutos a menos de 10ºC; y

(vii) detectar la actividad Lp-PLA2,

en donde al menos una muestra se ha tomado de un animal al que se le ha administrado un inhibidor Lp-PLA2

Ensayo de alto rendimiento para determinar la actividad de Lp-PLA2.

Campo de la invención

Esta invención se refiere generalmente a métodos y materiales para determinar la actividad de la enzima fosfolipasa A2 asociada a lipoproteina (denominada aquí "Lp-PLA2") en muestras de animales.

Antecedentes de la invención

La enfermedad coronaria del corazón (denominada aquí "CHD") es la principal causa de muerte en muchos países industriales. La aterosclerosis es una forma de arterioesclerosis o endurecimiento de las arterias en la que hay una construcción progresiva de la placa que contiene colesterol y lípidos en las arterias de la sangre. Esta construcción está asociada con un riesgo aumentado de enfermedad del corazón y eventos coronarios mórbidos. La construcción de la placa en las arterias está asociada con una respuesta inmune que se inicia por el daño al endotelio. Inicialmente, los macrófagos derivados de los monocitos se acumulan en el lugar del daño, debido a la respuesta inmune que causa la migración y acumulación de las células del músculo liso que forman la placa fibrosa en combinación con los macrófagos, lípidos, colesterol, sales de calcio y colágeno. El crecimiento de tales lesiones puede eventualmente bloquear la arteria y restringir el flujo sanguíneo.

La fosfolipasa A2 asociada a lipoproteína (Lp-PLA2), también conocida como PAF acetilhidrolasa, es un miembro secretado, independiente de calcio de la creciente superfamilia de la fosfolipasa A2 (Tew, et al. (1996) Arterioscler Thromb Vasc Biol. 16(4):591-9; Tjoelker, et al. (1995) Nature 374(6522):549-53). Es producida por monocitos, macrófagos, y linfocitos y está asociada predominantemente con LDL (~80%) en el plasma humano. El enzima escinde los fosfolípidos polares, que incluye el éster sn-2 de 1-O-alquil-2-acetil-sn-glicero-3-fosfocolina, también conocido como factor de activación de plaquetas (denominado aquí "PAF") (Tjoelker, et al. (1995) Nature 374(6522):549-53).

Muchas observaciones han demostrado una actividad proinflamatoria de LDL oxidado cuando se compara con las lipoproteínas no modificadas nativas. Uno de los acontecimientos más tempranos en la oxidación de LDL es la hidrólisis de la fosfatidilcolina modificada por oxidación, que genera cantidades sustanciales de lisofosfatidilcolina (liso-PC) y ácidos grasos oxidados. Esta hidrólisis está mediada únicamente por Lp-PLA2 (o sea, Lp-PLA2 hidroliza PAF para dar lisofosfatidilcolina ["liso-PC"] y acetato) (Stafforini, et al. (1997) J. Biol. Chem. 272, 17895).

Se sospecha que liso-PC es un mediador pro inflamatorio y pro aterogénico. Además de ser citotóxico a concentraciones más altas, puede estimular a monocitos y la quimiotaxis del linfocito T, así como inducir la adhesión molecular y la expresión de la citoquina inflamatoria a concentraciones más modestas. La liso-PC ha sido identificada también como el componente de LDL oxidado que está envuelto en la antigenicidad de LDL, un hecho que puede también contribuir a la naturaleza inflamatoria de la aterosclerosis. En adición, la liso-PC promueve la proliferación de macrófagos e induce la disfunción endotelial en varios senos arteriales. Los ácidos grasos oxidados que se liberan junto con liso-PC, son también monocitos quimioatrayentes y pueden también estar envueltos en otras actividades biológicas tales como la señalización celular. Ya que ambos de estos productos de la hidrólisis de Lp-PLA2 son quimioatrayentes potentes para los monocitos circulantes, se piensa que Lp-PLA2 es responsable de la acumulación de células cargadas con el éster de colesterol en las arterias, causando las características placas de ateroma asociadas con los estados tempranos de la aterosclerosis.

Se ha encontrado también que Lp-PLA2 está enriquecida en la lipoproteína altamente aterogénica subfracción de LDL de pequeña densidad, que es susceptible de modificación oxidativa. Además, los niveles de enzima están aumentados en pacientes con hiperlipidemia, accidente vascular, diabetes melitus tipo 1 y tipo 2, así como en mujeres postmenopáusicas. Como tal, los niveles Lp-PLA2 del plasma tienden a estar elevados en aquellos individuos que están considerados como que son de alto riesgo para desarrollar aterosclerosis acelerada y eventos cardiovasculares clínicos. De modo que se esperaría que la inhibición de la enzima Lp-PLA2 detendría la construcción de esta placa de ateroma (por inhibición de la formación de la lisofosfatidilcolina), y así ser útil en el tratamiento de la aterosclerosis. Además, Lp-PLA2 puede usarse como biomarcador para determinar si un animal está en riesgo de desarrollar una enfermedad asociada con niveles elevados de Lp-PLA2 o actividad elevada de Lp-PLA2.

Los inhibidores de Lp-PLA2 inhiben la oxidación de LDL. Los inhibidores de Lp-PLA2 pueden por tanto tener una aplicación general en cualquier alteración que envuelva la peroxidación de lípidos en conjunción con la actividad de la enzima, por ejemplo en adición a alteraciones tales como aterosclerosis y diabetes, otras alteraciones como artritis reumatoide, accidente vascular, infarto de miocardio (Serebruany, et al. Cardiology. 90(2):127-30 (1998)); y daño por reperfusión e inflamación aguda y crónica. Además, Lp-PLA2 está siendo explorada actualmente como un biomarcador de la enfermedad coronaria del corazón (Blankenberg, et al. J Lipid Res. 2003 Mayo 1) y arterioesclerosis (Tselepis y Chapman. Atheroscler Suppl. 3(4):57-68 (2002)). Además, se ha descrito que Lp-PLA2 juega un papel en las siguientes enfermedades: síndrome del distrés respiratorio (Grissom, et al. Crit Care Med. 31(3):770-5 (2003); nefropatía de la immunoglobulina A (Yoon, et al. Clin Genet. 62(2):128-34 (2002); apertura del injerto de bypass del femoropopliteo (Unno, et al. Surgery 132(1):66-71(2002); inflamación oral (McManus y Pinckard. Crit Rev Oral Biol Med. 11(2):240-58 (2000)); inflamación de las vías respiratorias e hiperreactividad (Henderson, et al. J Immunol. 15;164(6):3360-7 (2000)); VIH y SIDA (Khovidhunkit, et al. Metabolism. 48(12): 1524-31 (1999)); asma (Satoh, et al. Am J Respir Crit Care Med. 159(3):974-9 (1999)); artritis reumatoide juvenil (Tselepis, et al. Arthritis Rheum. 42(2):373-83 (1999)); exudados del oído medio humano (Tsuji, et al. ORL J Otorhinolaryngol Relat Spec. 60(1):25-9 (1998)); esquizofrenia (Bell, et al. Biochem Biophys Res Commun. 29;241(3):630-5 9 (1997)); desarrollo de enterocolitis necronizante (Muguruma, et al. Adv Exp Med Biol. 407:379-82 (1997)); y necrosis intestinal isquémica (Pediatr Res. 34(2):237-41 (1993)).

Otras referencias que ilustran los antecedentes técnicos son: Palmantier, et al, Biosíntesis de PAF-Acether XIV, PAF-Acether Output in Murine Peritoneal Macrophages is regulated by the level of acetylhydrolase, Biochemical and Biophysical Research Communication. Vol. 162, no. 1. 475-482 (1989); Stafforini, et al, Platelet - activating factor acetylhydrolase from human plasma, Methods in Enzymology. Vol. 187. 344-357 (1990); y Petrovic, et al, A simple assay for a human serum phospholipase A2 that is associated with high-density lipoproteins, Journal of lipid research. Vol. 42, no. 10. 1706-1713 (2001).

Se ha medido la actividad Lp-PLA2 de las muestras humana usando ensayos de actividad espectrofotométrica y ensayos de actividad fluorogénica (Cayman Chemical Company, AtheroGenics, Inc. y Karlan Research Products). Véase también Kosaka, et al. Clin Chem Acta 296(1-2):151-61 (2000) y Kosaka, et al. Clin Chem Acta 312(1-2):179-83 (2001). Sin embargo, estos métodos pueden no ser sensibles cuando el inhibidor de Lp-PLA2 está presente, particularmente cuando el inhibidor se administra a un animal antes de obtener una muestra del animal. Se ha descrito que el ensayo de la presente invención demuestra una correlación entre la concentración del inhibidor Lp-PLA2 en una muestra y la actividad Lp-PLA2. La actividad Lp-PLA2 medida frente al tiempo en pacientes tratados con el inhibidor correlaciona con el perfil farmacocinético del inhibidor.

Se ha usado PAF con marcaje radioactivo en ensayos de bajo rendimiento para la actividad de Lp-PLA2. Tselepis, et al. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 15(10):1764-73 (1995) y Min, et al. Biochemistry, 40 (15):4539-4549 (2001). Sin embargo, estos métodos no han sido desarrollados como métodos de alto rendimiento y por tanto no son útiles para estudios a gran escala comparados con la presente invención. La concentración...

1. Un método de alto rendimiento para determinar la actividad de una enzima fosfolipasa asociada a lipoproteína A2 (Lp-PLA2) en un conjunto de muestras que comprende las etapas de;

en donde al menos una muestra se ha tomado de un animal al que se le ha administrado un inhibidor Lp-PLA2.

2. El método de la reivindicación 1, en donde al menos una muestra se selecciona del grupo que consiste en suero, lisado celular, lisado tisular, orina o plasma sanguíneo.

3. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el PAF marcado está marcado con radioactividad.

4. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la concentración total de PAF en la solución de la etapa de preparación es al menos 20 µM.

5. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la solución que comprende PAF marcado y no marcado es una solución tamponada.

6. El método de la reivindicación 5, en donde la solución tamponada comprende HEPES, cloruro sódico (NaCl), y ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA).

7. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la solución de la etapa de preparación y la muestra se mezclan durante al menos 5 segundos y se incuban a 21ºC durante al menos 1 minuto.

8. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la molécula secuestrante de la etapa de contacto es albúmina de suero bovino exógeno (BSA).

9. El método de la reivindicación 8, en donde la BSA está a menos de 10ºC.

10. El método de la reivindicación 8, en donde la BSA está a 4ºC.

11. El método de las reivindicaciones 8 o 9, en donde la BSA tiene una concentración de 50 mg/ml.

12. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la molécula secuestrante de la etapa de contacto es albúmina de suero humano endógena.

13. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la solución de precipitación que comprende TCA está a menos de 10ºC.

14. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la centrifugación se lleva a cabo a 4ºC durante 15 minutos.

15. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la actividad Lp-PLA2 se mide por contaje de centelleo.

16. El método de la reivindicación 1, que comprende además tomar alícuotas de una solución tamponada en al menos dos receptáculos para uso como reacciones de contaje total o reacciones de blanco.

17. El método de la reivindicación 16, en donde los receptáculos son tubos de microcentrífuga o pocillos de una placa de microtítulo.

18. El método de la reivindicación 17 que comprende además, poner en contacto al menos una reacción de blanco con aproximadamente el mismo volumen y concentración de la solución de la etapa de preparación y molécula secuestrante y poner en contacto al menos dos alícuotas de la reacción de contaje total con aproximadamente el mismo volumen de solución de la etapa de preparación y una solución sustituta de la molécula secuestrante en donde la solución sustituta no contiene molécula secuestrante; tomar alícuotas de una parte de sobrenadante de cada muestra, reacción de blanco, y reacción de cuentas totales en receptáculos separados; y poner en contacto un cóctel de centelleo con cada dicha alícuota.