PROCEDIMIENTO PARA ENSAYAR SUSTANCIAS EN BIOMATRICES.

Procedimiento para ensayar una o más sustancias, en donde se cultiva un equivalente de tejido,

la o las sustancias se dejan actuar sobre el equivalente de tejido, y se determina si la acción de la o las sustancias llevó a una modificación del equivalente de tejido y/o de la o las sustancias, caracterizado porque el equivalente de tejido comprende por lo menos una célula de tejido y una matriz porosa a base de un polímero o mezcla de polímeros biocompatible, en donde la matriz presenta aprox. del 0,5 % al 6 % de poros con un diámetro medio en el rango de 70 a 100 µm; aprox. del 2 % al 8 % de poros con un diámetro medio en el rango de 101 a 115 µm; aprox. del 2 % al 8 % de poros con un diámetro medio en el rango de 116 a 130 µm; aprox. del 1 % al 7 % de poros con un diámetro medio en el rango de 131 a 300 µm; aprox. del 11 % al 23 % de poros con un diámetro medio en el rango de 301 a 330 µm; aprox. del 4 % al 10 % de poros con un diámetro medio en el rango de 331 a 360 µm; aprox. del 5 % al 17 % de poros con un diámetro medio en el rango de 361 a 390 µm; aprox. del 7 % al 19 % de poros con un diámetro medio en el rango de 391 a 420 µm; aprox. del 3 % al 9 % de poros con un diámetro medio en el rango de 421 a 450 µm; aprox. del 12 % al 24 % de poros con un diámetro medio en el rango de 451 a 480 µm; y aprox. del 5 % al 17 % de poros con un diámetro medio en el rango de 481 a 510 µm, el grado de porosidad es del 93 al 98 % y la matriz se puede obtener por medio de la compactación de una mezcla de partículas de polímero y partículas de sal común y luego la eliminación de la sal común por disolución

La invención se refiere a un procedimiento para ensayar sustancias en biomatrices. Las biomatrices representan equivalentes de tejidos, es decir, células de tejido sobre matrices porosas, las que se basan en polímeros o mezclas de polímeros biocompatibles. Otro objeto de la presente invención es por lo tanto el uso de los equivalentes de tejidos para ensayar sustancias. También se describen un procedimiento para la preparación de matrices porosas y las matrices que se obtienen de acuerdo con este procedimiento, un procedimiento especial para la obtención de células para la inoculación de las matrices y la preparación de los equivalentes de tejido.

La ingeniería de tejidos es un campo interdisciplinario que comunica a las ciencias de la ingeniería y las ciencias de los materiales con la medicina. El objetivo es reparar tejido dañado

o mejorar su función.

El principio de la ingeniería de tejidos es muy sencillo: primero se proveen células, por ejemplo, se retiran algunas células de un organismo y se reproducen in vitro. Las células reproducidas pueden ser incorporadas luego en una sustancia armazón, por medio de lo cual se obtiene un equivalente de tejido vivo, completo.

De especial importancia para la capacidad funcional de los equivalentes de tejido son el tipo y la estructura de la sustancia armazón utilizada, denominada a continuación también matriz. Aparte del material a utilizar, a saber, en general polímeros que se pueden degradar biológicamente, tienen un rol decisivo el tamaño de los poros, la porosidad y la superficie, como así también la forma de los poros, la morfología de la pared de los poros y la conectividad entre los poros, para el desarrollo ulterior de las células incorporadas en la sustancia armazón y finalmente para la formación tridimensional de los equivalentes del tejido. Se investigaron, por ejemplo, matrices tridimensionales con respecto a una utilización para el transplante de células hepáticas (Kaufmann, P.M. et al. (1999), Transplantation 68(2), págs. 272–279).

Ya se conocen procedimientos para la producción de biomatrices de este tipo. Se utilizaron para ello técnicas del campo textil, para fabricar biomatrices fibrosas tipo tejido y también tipo vellón. Otro procedimiento usual, en el cual se incorporan en el polímero biodegradable primero cristales de sal y a continuación se retiran nuevamente, posibilita controlar el tamaño de los poros por medio del tamaño de las partículas de sal y la porosidad por medio de la relación sal/polímero (WO 98/44027; Hou Q. et al. (2003), Biomaterials 24, págs. 1937–47; Harris L. D. et al. (1998), J. Biomed. Mater. Res. 42, págs. 396–403). En una modificación del procedimiento, los polímeros biodegradables, disueltos en un disolvente, se aplican sobre un así llamado material porogénico, el cual a continuación se retira nuevamente del material ligante, quedando de este modo poros con la forma de la imagen negativa del

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material porogénico mencionado (WO 01/87575 A2). También se conocen matrices recubiertas, así como también matrices a base de un hidrogel liofilizado (ver, por ejemplo, WO 99/09149 A1 y US 2004/0063206 A1).

La prueba con respecto a si una determinada sustancia es tóxica para el cuerpo animal, humano o no humano, es un paso decisivo para el desarrollo de un medicamento para el campo de la medicina humana y veterinaria. Fundamentalmente es deseable reconocer una toxicidad potencial tan pronto como sea posible. Con frecuencia hubo que retirar del mercado sustancias activas porque producían una insuficiencia hepática aguda, es decir, presentaban una toxicidad hepática no reconocida anteriormente.

En el pasado se realizaba la prueba toxicológica de las sustancias activas de medicamentos, pesticidas, aditivos alimentarios y otras sustancias del medio amiente o bien in vivo en animales de ensayo o en sistemas in vitro, como bacterias (por ejemplo, test de Ames) y cultivos de células animales. En los sistemas de ensayo bacterianos y algunos de los cultivos de células animales falta sin embargo una actividad metabólica, por lo que los productos tóxicos para el metabolismo no se pueden reconocer con estos sistemas. Para poder solucionar este problema se usaron en el pasado determinados extractos enzimáticos, por ejemplo, extractos de hígado de rata. La actividad metabólica simulada de esta manera no concuerda sin embargo necesariamente con la de los seres humanos o animales. Además puede suceder que metabolitos altamente reactivos no lleguen a las moléculas objetivo y de este modo no se puedan determinar.

Tampoco han faltado ensayos para cultivar células humanas diferenciadas con determinadas actividades metabólicas in vitro y así proveer un sistema de prueba con una similitud adecuada al metabolismo humano. Pero como las células diferenciadas sólo se pueden cultivar en forma condicionada, entre otros porque los tratamientos mecánicos y/o enzimáticos que se deben realizar necesariamente para la preparación de cultivos celulares con el objeto de individualizar las células, llevan a una pérdida y/o un daño de los contactos célula– célula, eran necesarias determinadas medidas, para poder establecer siquiera un cultivo de células correspondiente. Así se ensayó, por ejemplo, inmortalizar las células hepáticas, pero esto puede llevar a productos artificiales. Por otro lado, el tejido en cultivo muere normalmente después de un breve lapso de tiempo, ya que no está garantizado en general un intercambio suficiente de nutrientes y productos del metabolismo.

De este modo, los sistemas in vitro tienen la desventaja de que no pueden representar el metabolismo complejo del organismo humano o animal. De este modo, los resultados obtenidos con estos sistemas se pueden transpolar aún menos que los resultados de los ensayos en animales. El riesgo de una administración de las sustancias a ensayar y/o la captación de éstas,

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especialmente por los seres humanos, posiblemente no se pueda determinar o sólo en forma insuficiente.

El objetivo de la presente invención de proveer un equivalente de tejido funcional, con el cual se puedan realizar los tests mencionados en sustancias de manera satisfactoria, se alcanza por la invención por medio de determinadas biomatrices que se pueden obtener mediante un procedimiento especial y que sirven para la formación de un equivalente de tejido correspondiente.

El objeto de la presente invención es por lo tanto el procedimiento definido en las reivindicaciones de la patente. Se trata de un procedimiento in vitro.

Con respecto a las sustancias a ensayar se trata de sustancias con las cuales los seres humanos o los animales no humanos, especialmente los animales domésticos o los animales útiles, entran en contacto o pueden llegar a entrar en contacto, es decir, especialmente aquellas que son captadas o podrían ser captadas por el ser humano o un animal no humano. Por lo tanto, entre estas sustancias se cuentan especialmente sustancias activas de los campos de la Farmacia y la protección fitosanitaria, aditivos de alimentos y una cantidad de sustancias del medio ambiente, con las cuales el ser humano o los animales no humanos podrían entrar en contacto.

El procedimiento de acuerdo con la invención sirve en principio para investigar interacciones entre una sustancia a ensayar con el equivalente de tejido. Interacción en este contexto significa tanto un efecto de la sustancia sobre el equivalente de tejido, como también un efecto del equivalente de tejido sobre la sustancia.

Así, con el procedimiento de acuerdo con la invención se puede determinar especialmente, si el equivalente de tejido se modifica bajo el efecto de la sustancia. Una determinación de este tipo comprende en general la investigación de por lo menos un estado (parámetro) en el equivalente de tejido o en una parte del mismo que comprende por lo menos una célula. Como parámetro se pueden usar básicamente todas las magnitudes o medidas de observación que describen un estado determinado del equivalente de tejido. Entre estos se pueden mencionar, por ejemplo, parámetros citológicos, como la morfología celular, la vitalidad celular y la tasa de división celular, parámetros bioquímicos, como determinadas actividades del metabolismo, por ejemplo, la inducción de determinadas enzimas, y la formación de determinados productos del metabolismo, y parámetros de biología molecular, como la presencia de determinados ácidos nucleicos y proteínas.

Se pueden investigar...

1. Procedimiento para ensayar una o más sustancias, en donde se cultiva un equivalente de tejido, la o las sustancias se dejan actuar sobre el equivalente de tejido, y se determina si la acción de la o las sustancias llevó a una modificación del equivalente de tejido y/o de la o las sustancias, caracterizado porque el equivalente de tejido comprende por lo menos una célula de tejido y una matriz porosa a base de un polímero o mezcla de polímeros biocompatible, en donde la matriz presenta aprox. del 0,5 % al 6 % de poros con un diámetro medio en el rango de 70 a 100 µm; aprox. del 2 % al 8 % de poros con un diámetro medio en el rango de 101 a 115 µm; aprox. del 2 % al 8 % de poros con un diámetro medio en el rango de 116 a 130 µm; aprox. del 1 % al 7 % de poros con un diámetro medio en el rango de 131 a 300 µm; aprox. del 11 % al 23 % de poros con un diámetro medio en el rango de 301 a 330 µm; aprox. del 4 % al 10 % de poros con un diámetro medio en el rango de 331 a 360 µm; aprox. del 5 % al 17 % de poros con un diámetro medio en el rango de 361 a 390 µm; aprox. del 7 % al 19 % de poros con un diámetro medio en el rango de 391 a 420 µm; aprox. del 3 % al 9 % de poros con un diámetro medio en el rango de 421 a 450 µm; aprox. del 12 % al 24 % de poros con un diámetro medio en el rango de 451 a 480 µm; y aprox. del 5 % al 17 % de poros con un diámetro medio en el rango de 481 a 510 µm, el grado de porosidad es del 93 al 98 % y la matriz se puede obtener por medio de la compactación de una mezcla de partículas de polímero y partículas de sal común y luego la eliminación de la sal común por disolución.

2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque la matriz presenta aprox. del 1 % al 5 % de poros con un diámetro medio en el rango de 70 a 100 µm; aprox. del 3 % al 7 % de poros con un diámetro medio en el rango de 101 a 115 µm; aprox. del 3 % al 7 % de poros con un diámetro medio en el rango de 116 a 130 µm; aprox. del 2 % al 6 % de poros con un diámetro medio en el rango de 131 a 300 µm; aprox. del 13 % al 21 % de poros con un diámetro medio en el rango de 301 a 330 µm; aprox. del 5 % al 9 % de poros con un diámetro medio en el rango de 331 a 360 µm; aprox. del 7 % al 15 % de poros con un diámetro medio en el rango de 361 a 390 µm; aprox. del 9 % al 17 % de poros con un diámetro medio en el rango de 391 a 420 µm; aprox. del 4 % al 8 % de poros con un diámetro medio en el rango de 421 a 450 µm; aprox. del 14 % al 22 % de poros con un diámetro medio en el rango de 451 a 480 µm; y aprox. del 7 % al 15 % de poros con un diámetro medio en el rango de 481 a 510 µm.

3. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque la matriz presenta aprox. del 2 % al 4 % de poros con un diámetro medio en el rango de 70 a 100 µm; aprox. del 4 % al 6 % de poros con un diámetro medio en el rango de 101 a 115 µm; aprox. del 4 % al 6 % de poros con un diámetro medio en el rango de 116 a 130 µm; del 3 % al 5 % de poros con un diámetro medio en el rango de 131 a 300 µm; aprox. del 15 % al 19 % de poros

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con un diámetro medio en el rango de 301 a 330 µm; aprox. del 6 % al 8 % de poros con un diámetro medio en el rango de 331 a 360 µm; aprox. del 9 % al 13 % de poros con un diámetro medio en el rango de 361 a 390 µm; aprox. del 11 % al 15 % de poros con un diámetro medio en el rango de 391 a 420 µm; aprox. del 5 % al 7 % de poros con un diámetro medio en el rango de 421 a 450 µm; aprox. del 16 % al 20 % de poros con un diámetro medio en el rango de 451 a 480 µm; y aprox. del 9 % al 13 % de poros con un diámetro medio en el rango de 481 a 510 µm.

4. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque la matriz presenta aprox. el 3 % de poros con un diámetro medio en el rango de 70 a 100 µm; aprox. el 5 % de poros con un diámetro medio en el rango de 101 a 115 µm; aprox. el 5 % de poros con un diámetro medio en el rango de 116 a 130 µm; aprox. el 4 % de poros con un diámetro medio en el rango de 131 a 300 µm; aprox. el 17 % de poros con un diámetro medio en el rango de 301 a 330 µm; aprox. el 7 % de poros con un diámetro medio en el rango de 331 a 360 µm; aprox. el 11 % de poros con un diámetro medio en el rango de 361 a 390 µm; aprox. el 13 % de poros con un diámetro medio en el rango de 391 a 420 µm; aprox. el 6 % de poros con un diámetro medio en el rango de 421 a 450 µm; aprox. el 18 % de poros con un diámetro medio en el rango de 451 a 480 µm; y aprox. el 11 % de poros con un diámetro medio en el rango de 481 a 510 µm.

5. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el polímero biocompatible es un polímero biodegradable, seleccionado entre polímeros naturales, tales como albúmina, fibrinógeno, colágeno, gelatina, quitina, quitosano, agarosa, alginato, y polímeros sintéticos, tales como polianhídridos, poli(ε–caprolactona) y poli(α– hidroxiésteres).

6. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5, caracterizado porque el polímero biodegradable es poli(ácido glicólico–ácido láctico) con un contenido de ácido láctico de aprox. el 85 % en moles y un contenido de ácido glicólico de aprox. el 15 % en moles.

7. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque la superficie de la matriz está recubierta con por lo menos una proteína de la matriz extracelular, seleccionada entre colágenos, laminina y fibronectina.

8. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 7, caracterizado porque el recubrimiento contiene una mezcla de colágeno del tipo I, laminina y colágeno del tipo IV.

9. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la matriz porosa a base de un polímero o mezcla de polímeros biocompatible se puede obtener compactando una mezcla de partículas de polímero con un tamaño de grano en el rango de aprox. 20 a 950 µm, ventajosamente en el rango de aprox. 50 a 760 µm y especialmente en el rango de aprox. 108 a 250 µm y partículas de sal común con un tamaño de

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grano en el rango de aprox. 90 a 670 µm, ventajosamente en el rango de aprox. 110 a 520 µm y especialmente en el rango de aprox. 250 a 425 µm y a continuación eliminando la sal común por disolución.

10. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9, caracterizado porque la mezcla de partículas de sal común está compuesta por el 15 al 50 % en peso, preferentemente el 18 al 42 % en peso y especialmente el 22 al 28 % en peso de partículas con un tamaño de grano de 250 µm a 320 µm, el 20 al 65 % en peso, preferentemente el 30 al 52 % en peso y especialmente 42 a 46 % en peso de partículas con un tamaño de grano de 330 µm a 380 µm, y el 15 al 62 % en peso, preferentemente el 25 al 42 % en peso, y especialmente el 29 al 33 % en peso de partículas con un tamaño de grano de 390 µm a 425 µm.

11. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9, caracterizado porque la mezcla de partículas de sal común está compuesta por el 1 al 15 % en peso, preferentemente el 4 al 12 % en peso y especialmente el 7 al 9 % en peso de partículas con un tamaño de grano de 108 µm a 140 µm, el 1 al 11 % en peso, preferentemente el 3 al 9 % en peso y especialmente el 5 al 7 % en peso de partículas con un tamaño de grano de 145 µm a 180 µm, el 3 al 21 % en peso, preferentemente el 7 al 17 % en peso y especialmente el 10 al 14 % en peso de partículas con un tamaño de grano de 185 µm a 220 µm, el 1 al 11 % en peso, preferentemente el 3 al 9 % en peso y especialmente el 5 al 7 % en peso de partículas con un tamaño de grano de 225 µm a 250 µm, el 15 al 50 % en peso, preferentemente el 18 al 42 % en peso y especialmente el 22 al 28 % en peso de partículas con un tamaño de grano de 250 µm a 320 µm, el 15 al 50 % en peso, preferentemente el 18 al 42 % en peso y especialmente el 22 al 28 % en peso de partículas con un tamaño de grano de 330 µm a 380 µm, y el 5 al 29 % en peso, preferentemente el 10 al 24 % en peso y especialmente el 15 al 19 % en peso de partículas con un tamaño de grano de 390 µm a 425 µm.

12. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 9 a 11, caracterizado porque la mezcla de partículas de polímero está compuesta por el 5 al 50 % en peso, preferentemente el 10 al 30 % en peso y especialmente el 14 al 18 % en peso de partículas con un tamaño de grano de 108 µm a 140 µm, el 10 al 55 % en peso, preferentemente el 15 al 40 % en peso y especialmente el 20 al 24 % en peso de partículas con un tamaño de grano de 145 µm a 180 µm, el 18 al 88 % en peso, preferentemente el 32 al 76 % en peso y especialmente el 43 al 49 % en peso de partículas con un tamaño de grano de 185 µm a 220 µm, y el 5 al 45 % en peso, preferentemente el 10 al 28 % en peso y especialmente el 14 al 18 % en peso de partículas con un tamaño de grano de 225 µm a 250 µm.

13. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 9 a 12, caracterizado porque la relación de pesos entre las partículas de polímero y las partículas de sal común es de

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1:100 a 1:10, ventajosamente de 1:50 a 1:15 y especialmente de 1:20 a 1:18.

14. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 9 a 13, caracterizado porque antes de la compactación se agrega a la mezcla de partículas de polímero y partículas de sal común una solución de polímeros y se elimina el disolvente.

15. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 14, caracterizado porque el disolvente disuelve el polímero pero no la sal.

16. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 15, caracterizado porque el disolvente es seleccionado entre acetona, acetato de etilo, cloruro de metileno, cloroformo, hexafluoroisopropanol, hidrocarburos clorados y fluorados, alifáticos y aromáticos, tetrahidrofurano, etilmetilcetona, dietilcetona, y mezclas de estos.

17. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 15, caracterizado porque el polímero es poli(ácido glicólico), poli(ácido láctico) o poli(ácido glicólico–ácido láctico) y el disolvente es cloroformo.

18. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 14 a 17, caracterizado porque la relación de pesos entre las partículas de polímero y el polímero disuelto es de 10:1 a 1:100, ventajosamente de 2:1 a 1:25 y especialmente 1:1 a 1:10.

19. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9, caracterizado porque la compactación se realiza por la acción de presión.

20. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9, caracterizado porque para eliminar 20 la sal común por disolución se deja actuar agua sobre la mezcla compactada.

21. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 20, caracterizado porque se elimina de nuevo el agua.

22. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9, caracterizado porque la mezcla

compactada se almacena primero en una atmósfera de CO2 y luego se retira la sal común por 25 disolución.

23. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el equivalente de tejido comprende células de tejido de por lo menos dos tipos celulares, en donde las células del primer tipo celular son hepatocitos y las células del segundo tipo celular son células de los islotes de Langerhans.

24. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 23, caracterizado porque la relación entre hepatocitos y células de los islotes de Langerhans es de aprox. 106:3000.

25. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 23, caracterizado porque la relación entre hepatocitos y células de los islotes de Langerhans es de aprox. 106:3–200, ventajosamente de aprox. 106:10–100, especialmente de aprox. 106:20–80, y más preferentemente de aprox. 106:35–45.