BIOMATRIZ DE COLÁGENO Y MÉTODO PARA PRODUCIRLA.

Método de preparación de una biomatriz de colágeno, que comprende las siguientes etapas:

preparar fibras de colágeno a partir de colas de rata; transferir las fibras de colágeno a una solución de ácido acético con un valor pH de 3,0 hasta 4,0; incubar las fibras de colágeno en la solución de ácido acético a una temperatura de 2 hasta 10ºC durante un periodo de 3 hasta 14 días; separar las partículas de colágeno no disueltas, con lo cual se obtiene una solución de colágeno cuyo contenido de colágeno es de 3 a 8 mg/ml; y mezclar de la solución de colágeno obtenida con una solución tampón de 7,5 hasta 8,5 de pH a una temperatura de 2ºC hasta 10ºC y aumentar la temperatura para lograr la gelificación, con lo cual se obtiene una biomatriz con 1,5 hasta 4,0 mg de colágeno por 1 ml de biomatriz y un valor pH de 7,0 hasta 7,8

La presente invención se refiere a una biomatriz y a métodos para su preparación.

Las enfermedades de las articulaciones son trastornos muy comunes, que van acompañados de un gran número de molestias para las personas afectadas. Así por ejemplo, los defectos óseos y cartilaginosos juegan un papel 5 importante en la patogénesis de la artrosis y también en los estados postraumáticos y en las endoprótesis dislocadas. Estos defectos pueden tratarse con el empleo de hueso o cartílago autólogo u homólogo, o bien mediante materiales sustitutivos adecuados. Como no se dispone ilimitadamente de materiales autólogos, en el caso de los injertos homólogos hay que tener en cuenta los aspectos infecciológicos.

El principal problema de los trastornos degenerativos o traumáticos de las articulaciones reside en la poca 10 capacidad de regeneración del cartílago dañado. Un tratamiento conocido de estos defectos cartilaginosos es el implante autólogo de condrocitos (ACT) como método de terapia biológica. Con este método terapéutico se pudo detectar por primera vez la formación nueva de cartílago hialino en un defecto cartilaginoso articular.

El principio de este método se basa en inyectar células cartilaginosas del paciente, cultivadas in vitro después de desbridar el cartílago degenerado, bajo un colgajo perióstico cosido sobre el defecto (método Peterson). El 15 procedimiento es técnicamente complicado y plantea problemas metodológicos; por ejemplo, no garantiza que las células cartilaginosas permanezcan mucho tiempo en la grieta. Además no está claro que las células cartilaginosas cultivadas sean capaces de formar la matriz necesaria para rellenar permanentemente la grieta en el momento del trasplante. Las células trasplantadas se encuentran mayormente en un estado desdiferenciado y tienen similitudes morfológicas y fisiológicas con los fibroblastos. 20

De la patente DE 197 21 661 A1 se conoce el empleo de nuevos materiales, para sustituir huesos o cartílagos, que, aun siendo conocidos, se caracterizan por tener una estructura específica. Se trata de un implante de hueso o cartílago basado en una red tridimensional formada básicamente por un gran número de varillas de un material total o parcialmente bioabsorbible, dispuestas regularmente. Las varillas forman una estructura geométrica tridimensional cuya elasticidad y resistencia están adaptadas al tejido que debe reemplazarse en el cuerpo del paciente. Las varillas pueden 25 ser de poli-D-lactidas, poli-L-lactidas, poli-DL-lactidas, hidroxiapatitos, fosfatos cálcicos o mezclas de estas sustancias que contengan esencialmente fosfatos cálcicos o hidroxiapatitos, colágeno, agar o gelatina.

La patente WO 99/08728 revela una mezcla de factores ósteoinductivos o condroinductivos incluida en nanoesferas. También se revela un sistema formado por una matriz biodegradable que contiene, por ejemplo, colágeno de tipo I o de tipo II en el cual están incluidos los factores envueltos por las nanoesferas. Las nanoesferas están 30 constituidas por partículas poliméricas.

De la patente WO 95/33821 se conoce la elaboración de estructuras tridimensionales de colágeno cuyos intersticios están puenteados, p.ej. mediante fibroblastos o condrocitos, y esta retícula se cultiva en un medio de cultivo. En este documento se describe el cultivo de dichas células sobre una retícula tridimensional, así como el uso de este tejido artificial como prótesis cartilaginosa. 35

La patente WO 98/17791 describe la extracción y el uso de precursores de condrocitos, que pueden multiplicarse metódicamente por cultivo y utilizarse como tejido cartilaginoso terapéutico. También describe el cultivo de condrocitos sobre una retícula tridimensional cuyos intersticios van puenteados por los condrocitos.

La patente WO 99/00152 revela un método para producir un injerto bioartificial, que consiste en separar todas las células antígeno-reactivas de un tejido alógeno o xenógeno por tratamiento enzimático o químico y en colonizar con 40 las células autólogas deseadas el material libre de células y no desnaturalizado así obtenido, con lo cual resulta un injerto inmediatamente listo para trasplantar.

La desventaja de los métodos conocidos es que las células cartilaginosas trasplantadas o cultivadas no reasumen su capacidad sintetizadora original.

Las células cartilaginosas incluidas en la sustancia intracelular del cartílago - los condrocitos - se 45 desdiferencian precisamente durante el periodo de cultivo bajo condiciones in vitro. Mientras que las células cartilaginosas primarias (cultivo P0) aún muestran capacidades específicas para sintetizar células cartilaginosas después de su aislamiento del tejido cartilaginoso, como lo demuestra la formación de colágeno de tipo II, IX y XI, las células cultivadas pierden estas características típicas durante los sucesivos pasajes in vitro (P1-PX).

Asimismo, al contrario que otras células, las células cartilaginosas son difíciles de cultivar. Las células 50 cartilaginosas cultivadas se hallan en un estado desdiferenciado y se parecen morfológicamente y fisiológicamente a los fibroblastos. Sin embargo, sobre todo en caso de defectos grandes, es necesaria la multiplicación por cultivo de los condrocitos autólogos y su pasaje, para producir cantidades adecuadas de material de trasplante a partir de muestras pequeñas.

Hasta ahora, la desdiferenciación de las células cartilaginosas solo puede evitarse agregando estimulantes de crecimiento adicionales, lo cual dificulta el empleo in vivo de estos cultivos, pues los estimulantes de crecimiento pueden interactuar desfavorablemente con el sistema inmunológico del organismo receptor. Además, los métodos conocidos no aseguran que las células mantengan su metabolismo natural o casi natural durante el cultivo, incluso después de varios pasajes. 5

Con los métodos actuales, las estructuras tridimensionales conocidas para cultivar células cartilaginosas tampoco se pueden adaptar específicamente al correspondiente defecto del cartílago. Tampoco se garantiza que las células cartilaginosas trasplantadas permanezcan de manera duradera y diferenciada en el lugar del defecto, permitiendo la regeneración del cartílago.

Realmente no se conoce hasta la fecha ningún método de trasplante capaz de garantizar que las células 10 cartilaginosas trasplantadas permanezcan de manera duradera en el lugar del defecto, asegurando por tanto la correspondiente regeneración del cartílago.

Por lo tanto el problema técnico objeto de la presente invención consiste en proporcionar injertos cartilaginosos, así como métodos y medios para su producción, que permitan un mejor tratamiento de las afecciones de los cartílagos, sobre todo una mejor curación o regeneración del defecto cartilaginoso tratado. 15

La presente invención resuelve este problema ofreciendo medios para rediferenciar y/o multiplicar células cartilaginosas desdiferenciadas, a base de cultivar las células cartilaginosas desdiferenciadas en una biomatriz tridimensional gelatinosa donde puedan rediferenciarse y reanudar su actividad metabólica celular específica.

La biomatriz según la presente invención contiene un armazón de colágeno recién formado a partir de una solución de colágeno, preferentemente fresca, con una concentración mínima de 1,5 mg de colágeno/ml de biomatriz, 20 preferentemente 1,5 hasta 4 mg de colágeno/ml de biomatriz. Este armazón de colágeno se obtiene a partir de una disolución ácida de colágeno preferentemente exenta de células, preferiblemente con un valor pH de 0,1 hasta 6,9, preferentemente de 2,0 hasta 5,0, sobre todo de 3,0 hasta 4,5, en concreto de 3,2 hasta 4,2 y con especial preferencia de 3,8. Dicha solución de colágeno se prepara y se guarda entre 2 y 10ºC, preferiblemente a 4ºC. Para preparar una biomatriz libre de células, esta solución de colágeno se mezcla entre 2 y 10ºC, preferiblemente a 4ºC, con una solución 25 de medio, concretamente un medio corriente de cultivo celular, un tampón, por ejemplo HEPES, y suero, sobre todo suero humano autólogo, y se gelifica aumentando la temperatura, por ejemplo, hasta la temperatura ambiente o 37ºC. Para preparar una biomatriz que contenga células, se introducen células preferentemente precultivadas, por ejemplo células cartilaginosas o precursores de células cartilaginosas, en la solución de medio, tampón y suero, que luego se mezcla entre 2 y 10ºC, preferiblemente a 4ºC, con la solución de colágeno igualmente temperada entre 2 y 10ºC, 30... [Seguir leyendo]

1. Método de preparación de una biomatriz de colágeno, que comprende las siguientes etapas:

preparar fibras de colágeno a partir de colas de rata;

transferir las fibras de colágeno a una solución de ácido acético con un valor pH de 3,0 hasta 4,0;

incubar las fibras de colágeno en la solución de ácido acético a una temperatura de 2 hasta 10ºC durante un 5 periodo de 3 hasta 14 días;

separar las partículas de colágeno no disueltas, con lo cual se obtiene una solución de colágeno cuyo contenido de colágeno es de 3 a 8 mg/ml; y

mezclar de la solución de colágeno obtenida con una solución tampón de 7,5 hasta 8,5 de pH a una temperatura de 2ºC hasta 10ºC y aumentar la temperatura para lograr la gelificación, con lo cual se obtiene una biomatriz con 10 1,5 hasta 4,0 mg de colágeno por 1 ml de biomatriz y un valor pH de 7,0 hasta 7,8.

2. Método según la reivindicación 1, en que el contenido de fibras de colágeno en la solución de ácido acético es de 8 hasta 12 mg por 1 ml de la solución de ácido acético.

3. Método según la reivindicación 1 o 2, en que la concentración de la solución de ácido acético es del 0,1%.

4. Solución de colágeno preparada por el método según una de las reivindicaciones 1 a 3. 15

5. Biomatriz preparada por el método según una de las reivindicaciones 1 a 4.