Un polinucleótido aislado que comprende

a.una isla CpG libre de metilación extendida;

b.un marco de lectura abierto expresable operativamente ligado a dicha isla CpG libre de metilación extendida;

c.un promotor operativamente ligado a dicho marco de lectura abierto, en el que dicho promotor no está naturalmente ligado a dicha isla CpG;

caracterizado porque dicha isla CpG comprende un fragmento de un locus HP-1/hnRNP A2 humano de no más de 1,6 kb y en el que la expresión reproducible de dicho marco de lectura abierto se obtiene en dos o más tipos de tejido

Elementos genéticos mejorados que proporcionan altos niveles de expresión.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un polinucleótido que comprende un elemento de apertura de cromatina ubicuo (UCOE) más pequeño mejorado. Cuando está operativamente ligado a una secuencia de ácidos nucleicos expresable, este elemento proporciona niveles altos y reproducibles de expresión de genes. La presente invención también se refiere a un vector que comprende la secuencia de polinucleótidos, una célula huésped que comprende el vector y al uso del polinucleótido, vector o célula huésped en terapia, o para aplicaciones que implican la expresión de proteínas en cultivo celular.

Antecedentes de la invención

El presente modelo de estructura de cromatina en eucariotas superiores postula que los genes están organizados en "dominios" (Dillon, N. & Grosveld, F. Chromatin domains as potential units of eukaryotic gene function. Curr. Opin. Genet. Dev. 4, 260-264 (1994); Higgs, D.R. Do LCRs open chromatin domains? Cell 95, 299-302 (1998)). Se prevé que los dominios de cromatina existan bien un estado condensado "cerrado" transcripcionalmente silencioso o en una configuración descondensada "abierta" y transcripcionalmente competente. El establecimiento de una estructura de cromatina abierta caracterizada por un aumento de la sensibilidad a DNasaI, hipometilación de ADN e hiperacetilación de histonas se considera un requisito previo para el comienzo de la expresión de genes.

La naturaleza abierta y cerrada de las regiones de cromatina se refleja en el comportamiento de los transgenes que están aleatoriamente integrados en el genoma de células huésped. Constructos idénticos dan diferentes modelos de expresión específica de tejido y específica de fase de desarrollo cuando se integran en diferentes localizaciones en el genoma de ratón (Palmiter, R.D. & Brinster, R.L. Ann. Ref Genet. 20, 465-499 (1986); Allen, N.D. y col. Nature 333, 852-855 (1988); Bonnerot, C., Grimber, G., Briand, P. & Nicolas, J.F. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6331-6335 (1990)).

Frecuentemente también se observa un modelo de expresión variegado dentro de un tejido de ratón transgénico dado conocido como variegación por efecto de posición (PEV) (Kioussis, D. & Festenstein, R. Curr. Opin. Genet. Dev. 7, 614-619 (1997)). Cuando los genes exógenos están integrados en el cromosoma de cultivos de células de mamífero in vitro, muchos de los acontecimientos de integración dan como resultado el rápido silenciamiento del transgén y el resto da una gran variabilidad en los niveles de expresión (Pikaart, M.J., Recillas-Targa, F. & Felsenfield, G. Genes Dev. 12, 2852-2862 (1998); Fussenegger, M., Bailey, J.E., Hauser, H. & Mueller, P.P Trends Biotech. 17, 35-42 (1999)). Estos efectos de posición hacen ineficaz la expresión de transgenes con implicaciones en aplicaciones tanto de investigación básica como de biotecnología.

El modelo de dominios de cromatina para la organización de genes sugiere que los elementos de control genético que pueden establecer y mantener una estructura de cromatina abierta transcripcionalmente competente deben estar asociados a regiones activas del genoma.

Las regiones de control de locus (LCR) son una clase de elementos reguladores de la transcripción con capacidad de remodelación de la cromatina de largo alcance. Las LCR se definen funcionalmente en ratones transgénicos por su capacidad para conferir niveles fisiológicos independientes del sitio de integración, dependientes del número de copias de transgenes de expresión en un gen ligado en cis, especialmente transgenes de copia única, Fraser, P. & Grosveld, F. Curr. Opin. Cell Biol. 10, 361-365 (1998); Li, Q., Harju, S. & Peterson, K.R. Trends Genet. 15: 403-408 (1999). De forma crucial, tal expresión es específica de tejido. Las LCR pueden obstruir la propagación de heterocromatina, evitar el PEV (Kioussis, D. & Festenstein, R. Curr. Opin. Genet. Dev. 7, 614-619 (1997)) y estar constituidas por una serie de sitios hipersensibles (HS) a DNasaI que puede localizarse bien en 5' ó 3' de los genes que regulan (Li, Q., Harju, S. & Peterson, K.R. Trends Genet. 15: 403-408 (1999)).

Las LCR parecen estar constituidas por dos componentes separados, aunque no necesariamente independientes. Primero, el establecimiento de un "dominio de cromatina abierto" y segundo una capacidad de activación transcripcional dominante para conferir una expresión dependiente del número de copias de transgenes (Fraser, P. & Grosveld, F. Curr. Opin. Cell Biol. 10, 361-365 (1998). Los mecanismos moleculares mediante los que las LCR ejercen su función sigue siendo un punto de discrepancia (Higgs, D.R. Cell 95, 299-302 (1998); Bulger, M. & Groudine, M. Genes Dev. 13, 2465-2477 (1999); Grosveld, F. Curr. Opin. Genet. Dev. 9 152-157 (1999); Bender, M.A., Bulger, M., Close, J. & Groudine, M. Mol. Cell 5, 387-393 (2000).

La generación de líneas celulares de mamífero cultivadas que producen altos niveles de un producto proteínico terapéutico es una aplicación en desarrollo importante. Los efectos de posición de la cromatina hacen que sea un procedimiento difícil, que requiere mucho tiempo y caro. La solución más comúnmente usada para la producción de tales "fábricas de células" de mamífero se basa en la amplificación génica inducida por una combinación de un gen de resistencia a fármacos (por ejemplo, DHFR, glutamina sintetasa (Kaufman RJ. Methods Enzymol 185, 537-566 (1990)) y el mantenimiento de presión selectiva reducida. El uso de vectores que contienen LCR de dominios de genes sumamente expresados usando células derivadas del tejido apropiado simplifica mucho el procedimiento dando una gran proporción de líneas celulares clónicas que muestran niveles de expresión altos estables (Needham M, Gooding C, Hudson K, Antoniou M, Grosfeld F y Hollis M. Nucleic Acids Res 20, 997-1003 (1992); Needham M, Egerton M, Millest A, Evans S, Popplewell M, Cerillo G, McPheat J, Monk A, Jack A, Johnstone D y Hollis M. Protein Expr Purif 6,124-131 (1995).

Sin embargo, la especificidad de tejido de LCR, aunque es útil en algunas circunstancias, también es una gran limitación para muchas aplicaciones, por ejemplo, cuando no se conoce ninguna LCR para el tejido en el que se requiere la expresión, o cuando se requiere la expresión en muchos o todos los tejidos.

Las solicitudes de patente en tramitación junto con la presente PCT/GB99/02357 (documento WO 00/05393), US 09/358082, GB 0022995.5 y US 60/252.048 de los inventores incorporadas por referencia al presente documento describen elementos que son responsables, en su contexto cromosómico natural, de establecer una estructura de cromatina abierta a través de un locus que está constituido exclusivamente por genes de mantenimiento expresados ubicuamente. Estos elementos no se derivan de una LCR y comprenden islas CpG libres de metilación extendidas. Los inventores han usado el término elemento de apertura de cromatina ubicuo (UCOE) para describir tales elementos.

En ADN de mamífero, el dinucleótido CpG es reconocido por una enzima ADN metiltransferasa que metila la citosina en 5-metilcitosina. Sin embargo, la 5-metilcitosina es inestable y se convierte en timina. Como resultado, los dinucleótidos CpG se producen mucho menos frecuentemente que lo que se esperaría por casualidad. Sin embargo, algunas secciones de ADN genómico tienen una frecuencia de CpG que es más próxima a la esperada y estas secuencias se conocen como "islas CpG". Como se usa en este documento, una "isla CpG" se define como una secuencia de ADN de al menos 200 pb que tiene un contenido de GC de al menos el 50% y una relación de contenido de CpG observada/esperada de al menos 0,6 (es decir, un contenido de dinucleótido CpG de al menos el 60% del que se esperaría por casualidad) (Gardiner-Green M y Frommer M. J Mol Biol 196, 261-282 (1987); Rice P, Longden I y Bleasby A Trends Genet 16, 276-277 (2000).

Las islas CpG libres de metilación son muy conocidas en la técnica (Bird y col. (1985) Cell 40: 91-99, Tazi y Bird (1990) Cell 60: 909-920) y pueden definirse como islas CpG en las que una proporción sustancial de los residuos de citosina no están metilados y que normalmente se extienden por los extremos 5' de dos genes divergentemente transcritos poco espaciados (0,1-3 kb). Se presenta que estas regiones de ADN permanecen hipometiladas en todos los tejidos durante todo el desarrollo (Wise y Pravtcheva (1999) Genomics 60: 258-271). Frecuentemente están asociadas a los extremos 5' de genes ubicuamente expresados, mostrando además un 40% estimado...

1. Un polinucleótido aislado que comprende

caracterizado porque dicha isla CpG comprende un fragmento de un locus HP-1/hnRNP A2 humano de no más de 1,6 kb y en el que la expresión reproducible de dicho marco de lectura abierto se obtiene en dos o más tipos de tejido.

2. Un polinucleótido según la reivindicación 1 que comprende un fragmento de restricción Esp3I.

3. Un polinucleótido según la reivindicación 2 que comprende la secuencia de la Figura 2, nucleótidos 977 a 2522 (SEQ ID NO: 1), o un homólogo funcional del mismo.

4. Un polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 que comprende un fragmento de un locus HP-1/hnRNP A2 de no más de 1 kb.

5. El polinucleótido según la reivindicación 4 que comprende un fragmento de restricción BspE1-Esp3I.

6. Un polinucleótido según la reivindicación 5 que comprende la secuencia de la Figura 2, nucleótidos 1536 a 2522 (SEQ ID NO: 2), o un homólogo funcional del mismo.

7. Un vector que comprende el polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

8. Un vector según la reivindicación 7, en el que el vector es un vector episomal.

9. Un vector según la reivindicación 8, en el que el vector es un vector de integración.

10. Un vector según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en el que el vector es un plásmido.

11. Un vector según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, en el que el gen operativamente ligado es un ácido nucleico terapéutico.

12. Un vector según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11 que comprende cualquiera de SEQ ID NOs 1 ó 2, un promotor de CMV, un sitio de clonación múltiple, una secuencia de poliadenilación y genes que codifican marcadores de selección bajo elementos de control adecuados.

13. Una célula huésped que comprende el polinucleótido de cualquier de las reivindicaciones 1 a 6, o el vector de cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12.

14. Un polinucleótido aislado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, un vector según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12 o la célula huésped de la reivindicación 13 para uso en terapia génica.

15. Uso del polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, un vector según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12 o la célula huésped de la reivindicación 13 para la preparación de un medicamento para tratar inmunodeficiencia combinada grave (IDCG).

16. Un polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, un vector según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12 o la célula huésped de la reivindicación 13 para uso en el tratamiento de inmunodeficiencia combinada grave (IDCG).

17. Una composición farmacéutica del polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, un vector según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12 o la célula huésped de la reivindicación 13 en combinación con un excipiente farmacéuticamente aceptable.

18. Uso del polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, un vector según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12 o la célula huésped de la reivindicación 13 en un sistema de cultivo celular con el fin de obtener un producto génico deseado.

19. Uso ex vivo del polinucleótido según cualquiera de SEQ ID NOs 1 ó 2 para aumentar la expresión de un gen endógeno que comprende insertar el polinucleótido en el genoma de una célula en una posición operativamente asociada al gen endógeno, aumentando así el nivel de expresión del gen.

20. Un animal no humano transgénico que contiene células que comprenden un polinucleótido que comprende el polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, o un vector según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12, en el que dicho polinucleótido se ha introducido artificialmente.

21. Uso ex vivo del polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, un vector según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12 o la célula huésped de la reivindicación 13 para obtener expresión de una secuencia génica antisentido para inactivar la expresión de la secuencia génica correspondiente.

22. Uso del polinucleótido según cualquiera del polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, un vector según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12 en la preparación de una biblioteca de expresión.

23. Uso del polinucleótido según cualquier de SEQ ID NOs 1 ó 2 en un procedimiento para identificar genes expresables en un animal no humano que comprende insertar un constructo que comprende el polinucleótido en células madre embriónicas del animal no humano, en el que el constructo permite la selección de fármacos tras la inserción en genes expresados.