PROCEDIMIENTO PARA EL CULTIVO DE CELULAS PARA LA PRODUCCION DE SUBSTANCIAS.

Procedimiento para el cultivo de células de mamíferos para la producción de substancias,

caracterizado porque, se cultivan unas células de mamíferos que producen una substancia, con una limitación de glucosa, en donde el grado de limitación de la glucosa, DGL, es

DGL = qGlc/qGlcmáx

siendo

qGlc = grado de consumo específico de glucosa observado en el momento, y

qGlcmáx = grado de consumo máximo específico de glucosa conocido para estas células,

mayor que el grado de limitación de glucosa que conduce al mantenimiento exclusivo, DGLmantenimiento, de las células, y es =q 0,5, en donde

DGLmantenimiento = qGlcmantenimiento/qGlcmáx,

siendo

qGlcmantenimiento = en un metabolismo de mantenimiento puro, grado de consumo específico de glucosa observado, y

qGlcmáx = máximo grado de consumo específico de glucosa conocido para estas células,

en donde la cantidad de glucosa suministrada durante el procedimiento se mantiene constante

Procedimiento para el cultivo de células para la producción de substancias.

La invención se refiere a un procedimiento para el cultivo de células para la producción de substancias según el concepto general de la reivindicación 1.

En la producción de substancias, en particular de proteínas, se emplean cultivos celulares en procesos fermentativos. A este respecto, dichos procesos se diferencian de aquellos en que los cultivos celulares permanecen genéticamente invariables, y forman algunos productos de metabolismo, y de aquellos en que los organismos se modifican genéticamente de tal forma que o bien multiplican substancias propias, por ejemplo proteínas, o bien producen substancias extrañas, por ejemplo proteínas. Los organismos que producen las substancias se alimentan para ello con un medio nutritivo, el cual garantiza la supervivencia de los organismos y hace posible la producción del compuesto diana deseado. Para esta finalidad se conoce un gran número de medios de cultivo, que hacen posible la fermentación. Uno de los componentes más importante de los medios de cultivo es la glucosa. Según el estado actual de la técnica, se procura conseguir en una mezcla de fermentación que se mantenga una mínima concentración de glucosa correctamente, para optimizar el rendimiento del compuesto diana. La solicitud de patente japonesa 001 101 882 A, da a conocer un procedimiento de cultivo para células de mamíferos en el cual se mantiene constante una mínima concentración de 0,2 mmoles/litro de glucosa. La patente US 544 39 68 da a conocer un procedimiento de cultivo en el cual tiene lugar una limitación de la glucosa. El procedimiento no conduce sin embargo a un mayor grado específico de producción de las células respecto a una alimentación no limitante.

En la patente WO 98/41611 se describe un método para el cultivo de células que crecen en suspensión, mediante la adición de glucosa, en donde la cantidad de glucosa añadida se adecua siempre al estado momentáneo del cultivo.

Una finalidad de la invención es el de descubrir un procedimiento para el cultivo para la creación de células, con el cual aumente la productividad de las células individuales en el producto, y cómo hacer posible una alta densidad celular. Debe ser posible un alto rendimiento de la relación espacio/tiempo en el producto.

El procedimiento debe ser particularmente sencillo en su ejecución, unido a un mínimo gasto de medidas y de reglas, y particularmente económico.

Partiendo del concepto general de la reivindicación 1, se resuelve sorprendentemente la tarea, efectuando el cultivo de una línea celular que produce la substancia, mediante la alimentación con un medio nutritivo de manera que se ajuste en la solución del cultivo una limitación de glucosa. El grado de limitación de la glucosa puede definirse como la relación entre el grado de consumo específico de glucosa observado y el máximo grado de consumo de glucosa conocido para estas células. El grado de limitación de glucosa DGL = qGlc/qGlc_máx (qGlc = grado de consumo específico de glucosa observado en el momento; qGlc_máx = máximo grado de consumo específico de glucosa conocido para estas células). El DGL está entre los límites DGL_{mantenimiento} y 1, en donde el DGL_{mantenimiento} significa la limitación completa del crecimiento y 1 significa ninguna limitación o respectivamente, el exceso completo de glucosa.

Juntamente con la limitación de glucosa tiene lugar un continuo retroceso de la concentración de glucosa residual en una concentración estacionaría de la solución de cultivo, la cual es mayor de 0 mmoles/litro pero menor de 1 mmol/litro, de preferencia menor de 0,5 mmoles/litro. Hay que hacer notar que con la disminución del DGL se puede obtener otro aumento de la densidad de células vivas en el recipiente de cultivo. Con una limitación creciente de glucosa converge entonces la densidad celular hacia un valor máximo. De ello resulta que el grado de limitación de la glucosa converge hacia un valor mínimo, con lo cual el DGL según la invención es mayor o igual que el DGL que conduce al mantenimiento de las células (metabolismo de mantenimiento).

DGL_{mantenimiento} = qGlc_{mantenimiento}/qGlc_max (qGlc_{mantenimiento} = en el caso de metabolismo de mantenimiento puro, grado de consumo específico de glucosa observado; qGlc_máx = grado de consumo máximo de glucosa específico conocido para estas células), y la inferior a 0,5, de preferencia inferior a 0,4, con particular preferencia inferior a 0,3.

Es característico sin embargo, que con la disminución de la concentración de glucosa no se logra ninguna disminución de la concentración de células en la solución. Con una creciente limitación de las glucosa, a saber con valores decrecientes del DGL, aumenta la productividad específica de una célula. Puesto que la densidad de células vivas en el recipiente de cultivo no disminuye, esto conduce a un aumento del rendimiento espacio-tiempo. Con la incorporación de la limitación de las glucosa, tiene lugar fenomenológicamente una disminución del grado de formación específico de lactato. El grado de formación de lactato converge hacia un valor mínimo. Esto conduce a que la concentración de lactato residual en el recipiente de cultivo disminuya, máximo hasta 0. Con la limitación de la glucosa tiene lugar pues, una alteración del metabolismo celular.

Es importante que antes del empleo de la limitación de la glucosa no tenga lugar ninguna otra limitación de otro substrato. Por lo tanto el medio de crecimiento debe estar creado de modo que la glucosa sea limitada en primer lugar.

Con el procedimiento según la invención se aumenta el rendimiento espacio/tiempo para una densidad celular dada. Mediante el procedimiento según la invención la cantidad de glucosa disponible por célula disminuye de forma que la glucosa se incorpora principalmente al metabolismo de mantenimiento y unido a la misma el producto, y se incorpora menos en el crecimiento celular. El procedimiento según la invención no requiere por lo tanto ninguna regulación del suministro de glucosa, de manera que el procedimiento es particularmente fácil, puesto que puede prescindirse de una costosa regulación de la glucosa. Puesto que es necesaria una menor entrada del medio, se ahorra en el coste de la glucosa, puesto que es necesaria menos glucosa. Además, se logra una muy alta concentración del producto. Esto puede conducir a una disminución de los costes de retoque. El procedimiento según la invención hace posible en particular el aumento de la producción de proteínas, sin que además deba modificarse genéticamente una línea celular para la transformación del procedimiento según la invención. El aumento del título del producto hace posible la producción de la cantidad deseada de producto en un volumen de cultivo más pequeño, lo cual conduce a unos menores costes de inversión.

El procedimiento según la invención puede efectuarse según los siguientes pasos de procedimiento:

Las células deben cultivarse en un procedimiento continuo con separación de las células, por ejemplo, con un filtro centrífugo (cultivo por perfusión). Para ello son apropiadas todas las clases corrientes de recipientes de cultivo, como por ejemplo una caldera con agitación, y mecanismos de separación de las células, como por ejemplo filtros centrífugos, ultrasonidos o decantadores. De preferencia el sistema de cultivo debe hacer posible altas densidades celulares. De preferencia se efectúa una separación de las células, con el fin de que la densidad celular cuando actúe la limitación de la glucosa no pueda disminuir. Esto conduce a que cuando la densidad de las células vivas aumenta y se mantiene la alimentación de la glucosa, el DGL disminuye de nuevo. Una alta densidad celular hace posible una disminución del DGL por debajo de un valor de 0,4 con un grado de caudal ajustado a un orden de magnitud del grado máximo de crecimiento. Así pueden emplearse por ejemplo grados de caudal de 0,03 - 0,05 h^-1 para las células CHO MUC2-GFP-C-term empleadas, así como también para las células CHO/MUC1-IgG2a PH3744/25 empleadas.

Para conseguir una disminución del DGL, se puede proceder a la estrategia de alimentación con glucosa según lo siguiente: la cantidad de glucosa a suministrar no aumenta con un aumento de la densidad de células vivas para evitar una limitación de las glucosa. Antes bien, la cantidad de glucosa a suministrar durante el proceso se mantiene constante desde el principio. Por esto la cantidad...

1. Procedimiento para el cultivo de células de mamíferos para la producción de substancias, caracterizado porque, se cultivan unas células de mamíferos que producen una substancia, con una limitación de glucosa, en donde el grado de limitación de la glucosa, DGL, es

DGL = qGlc/qGlc_máx

siendo

qGlc = grado de consumo específico de glucosa observado en el momento, y

qGlc_máx = grado de consumo máximo específico de glucosa conocido para estas células,

mayor que el grado de limitación de glucosa que conduce al mantenimiento exclusivo, DGL_{mantenimiento}, de las células, y es =q 0,5, en donde

DGL_{mantenimiento} = qGlc_{mantenimiento}/qGlc_máx,

siendo

qGlc_{mantenimiento} = en un metabolismo de mantenimiento puro, grado de consumo específico de glucosa observado, y

qGlc_máx = máximo grado de consumo específico de glucosa conocido para estas células,

en donde la cantidad de glucosa suministrada durante el procedimiento se mantiene constante.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque, el DGL es =q 0,4 ó =q 0,3.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque, la cantidad de glucosa suministrada no es mayor del 50% de la que pueden consumir como máximo sin la limitación de la glucosa, el número máximo de células esperadas.

4. Procedimiento según la reivindicación 3, caracterizado porque, la cantidad de glucosa suministrada no es mayor del 35%, de la que pueden consumir como máximo sin la limitación de glucosa, el número máximo de células esperadas.

5. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque, se emplea un componente del grupo de las líneas celulares CHO, como por ejemplo CHO-K1, BHK, como por ejemplo BHK-21, hibridoma, células de mieloma, como por ejemplo NS/O, otras células de mamíferos y células de insectos u otras células superiores.

6. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque, las substancias producidas son proteínas o polipéptidos.

7. Procedimiento según la reivindicación 6, caracterizado porque, las substancias producidas son proteínas de fusión, la proteína de fusión MUC1-IgG2a, la glicoproteína MUC2-GFP-C-term, EPO, interferones, citocinas, factores de crecimiento, hormonas, PA, inmunoglobulinas, fragmentos de inmunoglobulinas u otras glicoproteínas.

8. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque, se emplea un medio que contiene glucosa el cual, respecto a otros componentes de substancias nutritivas no efectúa ninguna otra limitación antes del comienzo de la limitación de glucosa.

9. Procedimiento según la reivindicación 8, caracterizado porque, la glucosa se suministra separadamente de los otros substratos.

10. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque, se efectúa en un intervalo de pH de 6,7-7,7.

11. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque, se efectúa en un intervalo de temperaturas entre 35ºC y 38,5ºC.

12. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque, se efectúa de acuerdo con la modalidad continua de procedimiento, con por lo menos una separación parcial de las células.

13. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque, se efectúa de acuerdo con el procedimiento de Fed-Batch.

14. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque, da comienzo como un procedimiento por partidas y se continúa como un procedimiento de Fed-Batch o un procedimiento en continuo.

15. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizado porque, se efectúa con células productoras que no copulan con el crecimiento.