Procedimiento para el cribado de sustancias anti-cancerígenas anti-metastáticas capaces de invertir el fenotipo metastático hacia un fenotipo no metastático que comprende las etapas siguientes:

a) cultivar unas células metastáticas que no expresan la E-cadherina sobre su membrana celular;

b) poner en contacto las células cultivadas en la etapa a) con una sustancia o una combinación de sustancias candidata(s);

c) detectar, en el cultivo de células obtenido al final de la etapa b), la presencia de E-cadherina en la superficie celular;

d) seleccionar positivamente la sustancia o la combinación de sustancia candidata(s) cuando se ha detectado la E-cadherina en la etapa c)

Procedimiento para el cribado de sustancias anticancerígenas, estuche o kit para la realización del procedimiento.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere al campo de la identificación de moléculas de interés terapéutico para el tratamiento de los cánceres.

La presente invención tiene por objeto un procedimiento para el cribado de sustancias anti-cancerígenas anti-metastáticas capaces de invertir el fenotipo metastático hacia un fenotipo no metastático, que comprende las etapas siguientes:

La invención tiene asimismo por objeto un estuche o kit para el cribado de sustancias anticancerígenas anti-metastáticas capaces de invertir el fenotipo metastático hacia un fenotipo no metastático que comprende:

La invención se refiere asimismo a la utilización de un compuesto ligando de la parte extra-membranaria de la E-cadherina, para el cribado in vitro de sustancias anticancerígenas anti-metastáticas capaces de invertir el fenotipo metastático hacia un fenotipo no metastático.

Técnica anterior

Es conocido que, en algunos cánceres, las células tumorales tienen no sólo una fuerte capacidad para proliferar, sino también una fuerte capacidad para destruir los tejidos y para infiltrarse en los tejidos cercanos, incluyendo en los vasos sanguíneos y los vasos linfáticos, y después para migrar mediante la circulación sanguínea hacia unos tejidos localizados en unos sitios del cuerpo muy alejados del tumor primario. Así, en algunos cánceres, las células tumorales tienen la capacidad de circular y después de formar unos tumores secundarios, también denominados metástasis, en unos tejidos distantes del tumor primario.

Tal como se ha mencionado anteriormente, la formación de metástasis es un fenómeno fisiológico de etapas múltiples, durante el cual unas células tumorales se desprenden del tumor primario, invaden la matriz celular, penetran a través de los vasos sanguíneos, entran en el sistema vascular por intravasación, y después detienen su migración en la circulación sanguínea o linfática en un sitio distante, salen de la circulación mediante extravasación, y después se fijan en un tejido distante y proliferan para formar un tumor secundario.

Diferentes moléculas son susceptibles de desempeñar un papel en la formación de metástasis, incluyendo algunos receptores de quimioquinas o también integrinas.

En particular, se ha demostrado en el estado de la técnica que ciertas proteínas de la familia de las cadherinas eran susceptibles de estar implicadas en los mecanismos fisiológicos que conducen a la formación de metástasis.

La familia de las cadherinas es una familia de proteínas que poseen una actividad de regulación de la adhesión de las células epiteliales, endoteliales, neurales o cancerígenas. Diferentes tipos de cadherinas se expresan según los tejidos, tales como (i) la N-cadherina, que está expresada mayoritariamente por las células neurales, las células endoteliales y diversos tipos de células cancerígenas; (ii) la E-cadherina, que está expresada exclusivamente por las células epiteliales; (iii) la P-cadherina, que se encuentra a nivel de la piel en el ser humano; (iv) la R-cadherina, que se expresa en la retina.

Debido a la implicación de las cadherinas en la adhesión celular, se han propuesto en el estado de la técnica diversos procedimientos y productos capaces de modular la actividad de regulación de la adhesión celular en estas proteínas. Así, en la solicitud de patente US 2003/0109454, se ha propuesto modificar las funciones de las cadherinas con la ayuda de agentes moduladores proteicos que comprenden por lo menos un motivo "HAV", motivo que es esencial en el enlace entre dos moléculas de cadherinas, también denominado enlace homotípico. Según esta solicitud de patente americana, dichos agentes moduladores serían capaces de actuar sobre la adhesión celular y así facilitar el paso de medicamentos a través de los tejidos. La solicitud de patente US 2003/109454 describe asimismo un procedimiento que permite seleccionar unos agentes que modulan la adhesión celular, seleccionando positivamente los compuestos candidatos que se fijan sobre unos anticuerpos dirigidos contra una secuencia que contiene un motivo de adhesión "HAV". Asimismo, la solicitud de patente US 2002/0192724 describe la utilización de proteínas, en particular de anticuerpos, que se fijan sobre ciertas regiones extracelulares de las cadherinas, con vistas a modular la adhesión de los linfocitos T a las células que expresan unas cadherinas.

Se puede citar asimismo la patente US nº 6.468.790 que describe unas secuencias de proteínas que constituyen unos marcadores metastáticos para los cánceres de mama y del colon. Entre los numerosos marcadores descritos, se cita la E-cadherina, debido a que (i) el ARN mensajero que codifica la E-cadherina se encuentra en los extractos celulares de una línea de cáncer de mama no metastático (MCF7), pero que (ii) el ARN mensajero que codifica la E-cadherina no se encuentra en los extractos celulares de dos líneas de cáncer de mama no metastáticos (MDA-MB-231 y MDA-MB-435). En la patente US nº 6.468.790, se propone detectar el nivel de expresión de estos marcadores proteicos, o el nivel de expresión de los genes o ARN mensajeros correspondientes, con el fin de determinar los cánceres susceptibles de extenderse mediante la formación de metástasis. La patente US nº 6.468.790 propone asimismo unos procedimientos de cribado de medicamentos susceptibles de presentar un efecto anti-metastático. Según estos procedimientos de cribado, se incuba el compuesto candidato a ensayar con unas células cancerígenas, y se determina el nivel de expresión del marcador proteico, o del gen o del ARN mensajero correspondiente. El nivel de expresión del marcador proteico se lleva a cabo o bien (i) mediante la incorporación celular de aminoácidos marcados, y después mediante la detección de las proteínas marcadoras marcadas sobre un gel de poliacrilamida, o bien (ii) detectando las proteínas marcadoras con unos anticuerpos específicos, en unos ensayos de inmuno-huellas (también denominados "Western blots"). El nivel de expresión del gen que codifica el marcador proteico de interés se lleva a cabo mediante el análisis de los ARN mensajeros, según la técnica conocida denominada "Northern blot".

Sin embargo, los mecanismos de la iniciación y del desarrollo de las metástasis cancerígenas no se pueden explicar debido a la implicación de la única E-cadherina, y se sabe que numerosos factores están implicados en estos mecanismos. Así, a pesar de que, en la patente US nº 6.468.790, se muestra una desactivación de la expresión de proteínas tal como la E-cadherina, por unas células de cáncer metastático de mama, no se presenta ningún resultado capaz de mostrar (i) que una desactivación de la expresión de la E-cadherina es susceptible de transformar una célula cancerígena en célula cancerígena metastática, o a la inversa, (ii) que una activación de la expresión de la E-cadherina es susceptible de transformar una célula cancerígena metastática en célula no-metastá- tica.

Palmer, H. et al.; Journal of Cell Biology, vol. 154, nº 2, p. 369-387 describe los efectos de un derivado de la vitamina D3 (1a,25(OH)₂D₃ sobre la diferenciación de células derivadas de un carcinoma del colon. Pero el compuesto 1a,25(OH)₂D₃ no induce ninguna modificación fenotípica en la línea SW620 (seleccionada como línea celular de control).

Así, según le consta al solicitante, no existe en la actualidad ningún medio técnico que permita determinar el carácter potencialmente metastático de una célula cancerígena.

Además, según le consta...

1. Procedimiento para el cribado de sustancias anti-cancerígenas anti-metastáticas capaces de invertir el fenotipo metastático hacia un fenotipo no metastático que comprende las etapas siguientes:

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque en la etapa c) la detección se realiza poniendo en contacto las células obtenidas al final de la etapa b) con un compuesto ligando de la E-cadherina.

3. Procedimiento según la reivindicación 2, caracterizado porque el compuesto ligando de la E-cadherina se fija sobre la parte extra-membranaria de la E-cadherina.

4. Procedimiento según una de las reivindicaciones 2 ó 3, caracterizado porque el compuesto ligando está marcado mediante una molécula detectable.

5. Procedimiento según una de las reivindicaciones 2 a 4, caracterizado porque en la etapa c) se utiliza un compuesto ligando secundario que se fija sobre el compuesto ligando de la E-cadherina, estando dicho segundo compuesto ligando marcado por una molécula detectable.

6. Procedimiento según una de las reivindicaciones 2 a 5, caracterizado porque el compuesto ligando consiste en un anticuerpo anti E-cadherina.

7. Procedimiento según la reivindicación 6, caracterizado porque en la etapa c) se utiliza un compuesto ligando secundario que se fija sobre el anticuerpo anti E-cadherina, estando dicho segundo compuesto ligando marcado por una molécula detectable.

8. Procedimiento según la reivindicación 7, caracterizado porque el compuesto ligando secundario comprende una molécula de estreptavidina acoplada o fusionada a una enzima.

9. Procedimiento según la reivindicación 7, caracterizado porque el segundo compuesto ligando es un anticuerpo dirigido contra el anticuerpo anti E-cadherina.

10. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque las células metastáticas se seleccionan de entre las líneas celulares siguientes: SW620 (ATCC nº CCL-227), SKCo-1 (ATCC nº HTB-39) y CoLo205 (ATCC nº CCL-222).

11. Estuche o kit para el cribado de sustancias anti-cancerígenas anti-metastáticas capaces de invertir el fenotipo metastático hacia un fenotipo no metastático que comprende:

12. Estuche o kit según la reivindicación 11, caracterizado porque el compuesto ligando de la E-cadherina se fija sobre la parte extra-membranaria de la E-cadherina.

13. Estuche o kit según una de las reivindicaciones 11 ó 12, caracterizado porque el compuesto ligando de la E-cadherina consiste en un anticuerpo anti-E-cadherina.

14. Estuche o kit según una de las reivindicaciones 11 a 13, caracterizado porque comprende además un compuesto ligando secundario que se fija sobre el compuesto ligando de la E-cadherina, estando dicho compuesto ligando marcado por una molécula detectable.

15. Estuche o kit según la reivindicación 14, caracterizado porque el segundo compuesto ligando es un anticuerpo dirigido contra el anticuerpo anti E-cadherina.

16. Estuche o kit según la reivindicación 15, caracterizado porque el compuesto ligando secundario consiste en un anticuerpo anti-peroxidasa que es reconocido por el anticuerpo dirigido contra el anticuerpo anti-E-cadherina, estando dicho anticuerpo anti-peroxidasa unido a dos moléculas de peroxidasa a nivel de su sitio de unión al antígeno (CDR).

17. Utilización de un compuesto ligando de la parte extra-membranaria de la E-cadherina, para el cribado in vitro de sustancias anti-cancerígenas anti-metastáticas capaces de invertir el fenotipo metastático hacia un fenotipo no metastático.

18. Utilización según la reivindicación 17, caracterizada porque el compuesto ligando se utiliza conjuntamente con un cultivo de células metastáticas que no expresan la E-cadherina sobre su membrana celular.