EFECTO SINERGICO DE LA ASOCIACION DE FITASAS SOBRE LA HIDROLISIS DEL ACIDO FITICO.

Composición que asocia por lo menos dos fitasas para la hidrólisis del ácido fítico (mio-inositol 1,

2,3,4,5,6-hexakis fosfato), caracterizada porque comprende:

a) una primera fitasa que presenta por lo menos un 80% de identidad con la fitasa de la SEC ID nº 1 o que presenta por lo menos un 80% de identidad con la fitasa de la SEC ID nº 2, que es una 3-fitasa que cataliza la hidrólisis de los seis enlaces fosfato del ácido fítico;

b) una segunda fitasa que presenta por lo menos un 80% de identidad con la fitasa de la SEC ID nº 3, que es una 3-fitasa que cataliza la hidrólisis de por lo menos cinco enlaces fosfato del ácido fítico

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/FR2006/001652.

Solicitante: ADISSEO FRANCE S.A.S..

Nacionalidad solicitante: Francia.

Dirección: IMMEUBLE ANTONY PARC II 10, PLACE DU GENERAL DE GAULLE,92160 ANTONY.

Inventor/es: BOZE,HELENE, MOULIN,GUY.

Fecha de Publicación: .

Fecha Concesión Europea: 21 de Abril de 2010.

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C12N9/16 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN (biocidas, productos que repelen o atraen a los animales nocivos, o reguladores del crecimiento de los vegetales, que contienen microorganismos virus, hongos microscópicos, enzimas, productos de fermentación o sustancias obtenidas por o extraídas de microorganismos o sustancias animales A01N 63/00; preparaciones de uso médico A61K; fertilizantes C05F ); PROPAGACION,CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 9/00 Enzimas, p. ej. ligasas (6.; Proenzimas; Composiciones que las contienen (preparaciones para la limpieza de los dientes que contienen enzimas A61K 8/66, A61Q 11/00; preparaciones de uso médico que contienen enzimas A61K 38/43; composiciones detergentes que contienen enzimas C11D ); Procesos para preparar, activar, inhibir, separar o purificar enzimas. › actúan sobre los enlaces éster (3.1).
  • C12P3/00 C12 […] › C12P PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN ENZIMAS PARA LA SINTESIS DE UN COMPUESTO QUIMICO DADO O DE UNA COMPOSICION DADA, O PARA LA SEPARACION DE ISOMEROS OPTICOS A PARTIR DE UNA MEZCLA RACEMICA.Preparación de elementos o compuestos inorgánicos excepto anhídrido carbónico.
  • C12P7/18 C12P […] › C12P 7/00 Preparación de compuestos orgánicos que contienen oxígeno. › Polioles.

Clasificación PCT:

  • A23K1/165 SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA.A23 ALIMENTOS O PRODUCTOS ALIMENTICIOS; SU TRATAMIENTO, NO CUBIERTO POR OTRAS CLASES.A23K ALIMENTOS PARA ANIMALES; METODOS ESPECIALMENTE ADAPTADOS PARA SU PRODUCCION.A23K 1/00 Productos alimenticios para animales. › con esteroides, hormonas o enzimas.
  • C12N9/16 C12N 9/00 […] › actúan sobre los enlaces éster (3.1).
  • C12P3/00 C12P […] › Preparación de elementos o compuestos inorgánicos excepto anhídrido carbónico.
  • C12P7/18 C12P 7/00 […] › Polioles.

Fragmento de la descripción:

Efecto sinérgico de la asociación de fitasas sobre la hidrólisis del ácido fítico.

La invención se refiere al efecto sinérgico de la asociación de fitasas sobre la hidrólisis del ácido fítico.

Las sales del ácido fítico (mio-inositol hexakis fosfato) o fitatos (mio-inositol hexakis dihidrogenofosfato) son la forma principal de almacenamiento del fósforo en los cereales, las plantas leguminosas y oleaginosas. De este modo, constituyen la fuente principal de fósforo en los alimentos para animales a base de plantas, componentes principales de los regímenes de los animales monogástricos (aves de corral y cerdos). Sin embargo, la biodisponibilidad de este fósforo en los alimentos está limitada para dichos animales. En efecto, estos no poseen las enzimas intestinales que degradan los fitatos en una cantidad suficiente para permitir la hidrólisis de los fitatos y proporcionar de este modo las cantidades de fosfato inorgánico que les son necesarias. Además, el ácido fítico es un factor antinutricional, que forma unos complejos con las proteínas y los iones (Fe3+, Ca2+, Zn2+, Mg2+) y, por lo tanto, disminuye la disponibilidad de estos elementos.

En consecuencia, las raciones alimenticias de las aves de corral y de los cerdos se deben suplementar con fosfato inorgánico, mientras que el fósforo de los fitatos es excretado y contribuye a la eutrofización de las aguas de superficie en las zonas de cría intensiva de animales monogástricos.

Las fitasas (mio-inositol hexakis fosfato 3- y 6-fosfohidrolasas EC 3.1.3.8 y 3.1.3.26) forman parte de la familia de las histidinas fosfatasas ácidas. Las fitasas son unas hexakisfosfohidrolasas que hidrolizan los enlaces fosfo-ésteres presentes en el ácido fítico o el fitato. De este modo, catalizan la hidrólisis del mio-inositol hexakisfosfato (ácido fítico, InsP6) en monofosfatos inorgánicos y en mio-inositoles fosfato con un grado de fosforilación inferior (InsP5 a InsP1) y en mio-inositol libre en algunos casos.

Existen dos subclases de fitasas, diferenciadas únicamente por la posición del primer fosfato hidrolizado. Las 3-fitasas (EC 3.1.3.8) hidrolizan el fosfato en posición 3 y las 6-fitasas (EC 3.1.3.26) hidrolizan el fosfato en posición 6.

Estas enzimas utilizadas como aditivo en alimentación animal permiten, por un lado, aumentar la disponibilidad del fósforo fítico y, por otro lado, mejorar la digestibilidad de los alimentos. Además, la liberación de fosfato fítico disminuye considerablemente los costes debidos a la suplementación con fosfato, así como la contaminación provocada por un exceso de fosfatos excretados.

Las fitasas son producidas por una gran variedad de organismos: plantas, animales y, sobre todo, microorganismos. Estas fitasas presentan unas características bioquímicas muy diferentes, particularmente su actividad en función del pH y su estabilidad a la temperatura. Además, estas enzimas presentan diferencias a nivel de: (a) su eficacia a la hora de hidrolizar la totalidad de los fosfatos, (b) su estereoespecificidad, (c) su afinidad con respecto a los inositoles fosfatos.

Entre los microorganismos productores de fitasas, se citarán en particular: los hongos de los géneros Aspergillus, Penicillium, Mucor y Rhizopus, las bacterias Pseudomonas sp., Klebsiella sp., Escherichia coli, Enterobacter sp., Bacillus subtilis y las levaduras: Saccharomyces cerevisiae, Candida tropicalis, Torulopsis candida, Debaryomyces castellii, Debaryomyces occidentalis (sinónimo Schwanniomyces castellii), Kluyveromyces fragilis.

Ya se han estudiado y utilizado numerosas fitasas de microorganismos en diversas aplicaciones agroindustriales. La eficacia de estas enzimas en el alimento y en el transcurso de la digestión en el animal depende de su capacidad para mantener su potencial sean cuales sean las diferentes condiciones encontradas a lo largo de las etapas de preparación del alimento, así como dentro del tracto digestivo. La preparación de los alimentos requiere unas enzimas termorresistentes, mientras que los valores de pH varían, por ejemplo, entre 5,02, 2,75, 6,28, 6,63 y 5,98 durante el paso a través de los diversos compartimentos del buche, el estómago, el duodeno, el yeyuno y el íleon de las aves de corral.

La mayoría de las fitasas descritas hasta el momento hidrolizan el ácido fítico solo parcialmente, y algunas de ellas con cinéticas muy lentas. Así, numerosas fitasas hidrolizan únicamente 5 enlaces fosfato del ácido fítico, es decir el 83% del fósforo potencial.

Actualmente, de entre las levaduras, únicamente la fitasa de la levadura Schwanniomyces occidentalis ha sido descrita como capaz de hidrolizar todos los enlaces fosfato del fitato (EP 0 699 762 y Segueilha L., Lambrechts C., Boze H., Moulin G., Galzy P., (1992) Purification and properties of a phytase from Schwanniomyces castellii, J. Ferm. Bioeng., 74, 7-11).

En condiciones experimentales, sin embargo, no se obtiene una hidrólisis completa del fitato o del ácido fítico.

Así, para obtener una hidrólisis más eficaz del ácido fítico, se ha propuesto combinar diferentes fitasas.

El documento WO 98/30681 describe la combinación de fitasas con diferentes estereoespecificidades y, particularmente, la combinación de 3-fitasa y 6-fitasa. Este documento describe particularmente la combinación de una 6-fitasa de Peniophora lycii y una 3-fitasa de Aspergillus niger (fitasa NovoTM).

La patente US nº 6.183.740 describe asimismo la combinación de fitasas de diferentes estereoespecificidades, así como la combinación con otras fosfatasas ácidas.

Sin embargo, no se observa una hidrólisis completa del ácido fítico en fosfato y en inositol.

El problema que la presente invención se propone resolver consiste en mejorar la velocidad y la eficacia de hidrólisis del ácido fítico a efectos de obtener una hidrólisis completa del ácido fítico en diversas aplicaciones agroindustriales.

Este problema se resuelve mediante las composiciones y los procedimientos según la presente invención, en los que se asocian por lo menos dos fitasas específicas. De forma ventajosa, las composiciones según la presente invención permiten una hidrólisis completa de todos los agrupamientos fosfato del ácido fítico gracias al efecto sinérgico observado. Ventajosamente, las composiciones según la presente invención son activas en una amplia zona de pH adaptada a las aplicaciones agroindustriales de las fitasas, y particularmente a las aplicaciones en el ámbito de la alimentación animal. Otra ventaja de la presente invención consiste en que las fitasas utilizadas son termoestables.

Descripción de las secuencias

SEC ID nº 1: Fitasa de Schwanniomyces castellii.

SEC ID nº 2: Fitasa de Debaryomyces castellii.

SEC ID nº 3: Fitasa de Aspergillus niger.

SEC ID nº 4: Fitasa de Penicillium funiculosum.

SEC ID nº 5: Fitasa de Peniophora lycii.

SEC ID nº 6: Secuencia que codifica para la fitasa de trigo.

SEC ID nº 7: Fitasa de trigo (Triticum aestivum).

Descripción de la invención

La presente invención tiene por objeto una composición que asocia por lo menos dos fitasas para la hidrólisis del ácido fítico (mio-inositol 1,2,3,4,5,6-hexakis fosfato), que comprende:

- una primera fitasa que presenta por lo menos un 80% de identidad con la fitasa de la SEC ID nº 1, o que presenta por lo menos un 80% de identidad con la fitasa de la SEC ID nº 2;
- una segunda fitasa que presenta por lo menos un 80% de identidad con la fitasa de la SEC ID nº 3.

Preferentemente, la primera fitasa es una 3-fitasa que cataliza la hidrólisis de los seis enlaces fosfato del ácido fítico.

Preferentemente, la primera fitasa tiene una temperatura óptima comprendida entre 55ºC y 80ºC, y un pH óptimo comprendido entre 3,5 y 5.

En una forma de realización preferida, la primera fitasa es una fitasa de la levadura Schwanniomyces castellii o una fitasa de la levadura Debaryomyces castellii.

En otra forma de realización preferida, la primera fitasa es la fitasa de la SEC ID nº 1 o la fitasa de la SEC ID nº 2.

Preferentemente, la segunda fitasa es una 3-fitasa que cataliza...

 


Reivindicaciones:

1. Composición que asocia por lo menos dos fitasas para la hidrólisis del ácido fítico (mio-inositol 1,2,3,4,5,6-hexakis fosfato), caracterizada porque comprende:

a) una primera fitasa que presenta por lo menos un 80% de identidad con la fitasa de la SEC ID nº 1 o que presenta por lo menos un 80% de identidad con la fitasa de la SEC ID nº 2, que es una 3-fitasa que cataliza la hidrólisis de los seis enlaces fosfato del ácido fítico;
b) una segunda fitasa que presenta por lo menos un 80% de identidad con la fitasa de la SEC ID nº 3, que es una 3-fitasa que cataliza la hidrólisis de por lo menos cinco enlaces fosfato del ácido fítico.

2. Composición según la reivindicación anterior, caracterizada porque la primera fitasa tiene una temperatura óptima comprendida entre 55ºC y 80ºC, y un pH óptimo comprendido entre 3,5 y 5.

3. Composición según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la primera fitasa es una fitasa de la levadura Schwanniomyces castellii o una fitasa de la levadura Debaryomyces castellii.

4. Composición según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la primera fitasa es la fitasa de la SEC ID nº 1 o la fitasa de la SEC ID nº 2.

5. Composición según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la segunda fitasa tiene una temperatura óptima comprendida entre 50ºC y 60ºC y un pH óptimo comprendido entre 2 y 6.

6. Composición según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la segunda fitasa es una fitasa de Aspergillus niger.

7. Composición según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la segunda fitasa es la fitasa de la SEC ID nº 3.

8. Composición según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque consiste en un aditivo nutricional para animales o en un alimento para animales.

9. Utilización de una composición según una de las reivindicaciones 1 a 7, para la preparación de un aditivo nutricional para animales o de un alimento para animales.

10. Utilización de una composición según una de las reivindicaciones 1 a 8, para aumentar la disponibilidad del fósforo fítico y mejorar la digestibilidad de los alimentos para animales.

11. Procedimiento de hidrólisis del ácido fítico (mio-inositol 1,2,3,4,5,6-hexakis fosfato) en monofosfatos inorgánicos, en mio-inositoles de grado de fosforilación inferior y en mio-inositol libre, caracterizado porque comprende las siguientes etapas:

a) disponer de una primera fitasa que presenta por lo menos un 80% de identidad con la fitasa de la SEC ID nº 1 o que presenta por lo menos un 80% de identidad con la fitasa de la SEC ID nº 2, que es una 3-fitasa que cataliza la hidrólisis de los seis enlaces fosfato del ácido fítico;
b) disponer de una segunda fitasa que presenta por lo menos un 80% de identidad con la fitasa de la SEC ID nº 3, que es una 3-fitasa que cataliza la hidrólisis de por lo menos cinco enlaces fosfato del ácido fítico;
c) poner en contacto simultáneamente el ácido fítico con la primera fitasa y la segunda fitasa.

12. Procedimiento según la reivindicación 11, caracterizada porque la primera fitasa tiene una temperatura óptima comprendida entre 55ºC y 80ºC, y un pH óptimo comprendido entre pH 3,5 y pH 5.

13. Procedimiento según una de las reivindicaciones 11 ó 12, caracterizada porque la primera fitasa es una fitasa de la levadura Schwanniomyces castellii o una fitasa de la levadura Debaryomyces castellii.

14. Procedimiento según una de las reivindicaciones 11 a 13, caracterizado porque la primera fitasa es la fitasa de la SEC ID nº 1 o la fitasa de la SEC ID nº 2.

15. Procedimiento según una de las reivindicaciones 11 a 14, caracterizada porque la segunda fitasa tiene una temperatura óptima comprendida entre 50ºC y 60ºC, y un pH óptimo comprendido entre pH 2 y pH 6.

16. Procedimiento según una de las reivindicaciones 11 a 15, caracterizado porque la segunda fitasa es una fitasa de Aspergillus niger.

17. Procedimiento según una de las reivindicaciones 11 a 16, caracterizado porque la segunda fitasa es la fitasa de la SEC ID nº 3.

18. Kit o conjunto para la alimentación de los animales, caracterizado porque comprende:

a) la fitasa de Schwanniomyces castellii de la SEC ID nº 1 o la fitasa de Debaryomyces castellii de la SEC ID nº 2;
b) la fitasa de Aspergillus niger de la SEC ID nº 3.

 

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