Un polinucleótido que:

(a) codifica un polipéptido que tiene actividad metilarginasa,

seleccionándose dicho polinucleótido de:

(1) la secuencia codificante de la SEC ID Nº: 3; y

(2) una secuencia que está degenerada como resultado del código genético con respecto a una secuencia definida en (1); o

(b) es una secuencia complementaria a un polinucleótido definido en (a)

Dimetilarginina dimetilaminohidrolasa.

Método de exploración.

Campo técnico de la invención

Esta invención se refiere a métodos de exploración para compuestos que regulen específicamente diferentes isoformas de dimetilarginina dimetilaminohidrolasa.

Antecedentes de la invención

Los restos arginina en proteínas se metilan por una familia de proteínas arginina N-metiltransferasas (PRMT). Estas enzimas catalizan la metilación de nitrógenos guanidino de arginina para producir N^G monometil-L-arginina (L-NMMA), N^GN'^G dimetil-L-arginina (dimetilarginina asimétrica; ADMA) y N^GN^G dimetilarginina (dimetilarginina simétrica; SDMA). La proteolisis de proteínas que contienen estos restos libera metilargininas libres. Aunque el papel biológico de restos metilarginina no está claro, la L-NMMA y ADMA libres, pero no la SDMA, son inhibidores de las tres isoformas de la óxido nítrico sintasa (NOS) y podrían alterar la actividad de NOS en la salud o en la enfermedad.

Las metilargininas libres se encuentran en el citosol celular, plasma y tejidos y sus concentraciones difieren entre tejidos y entre regiones dentro de un solo tejido u órgano. Se han detectado concentraciones elevadas de ADMA en células endoteliales que repueblan vasos sanguíneos dañados por lesión con globo, en el plasma de pacientes o animales experimentales con hiperlipidemia, insuficiencia renal o aterosclerosis y en pacientes con esquizofrenia o esclerosis múltiple. Una biosíntesis alterada del óxido nítrico (NO) se ha implicado en la patogénesis de todas estas afecciones y es posible que la acumulación de ADMA endógena sea la causa subyacente de la inhibición de la generación de NO.

La producción de metilargininas es probablemente una etapa obligatoria en la renovación de proteínas y las velocidades de producción pueden mostrar variaciones temporales y específicas de tejido. Sin embargo, la L-NMMA y ADMA, pero no la SDMA, se metabolizan activamente a citrulina y metilaminas por acción de la dimetilarginina dimetilaminohidrolasa (DDAH). Ciertos tejidos que expresan NOS también parecen expresar DDAH. La inhibición farmacológica de DDAH aumenta la concentración de ADMA en células endoteliales e inhibe la relajación dependiente del endotelio mediada por NO de los vasos sanguíneos. Estas observaciones sugieren que la actividad de DDAH asegura que la concentración local de ADMA no aumente normalmente lo suficiente para afectar a la generación de NO, y que los cambios en la actividad de DDAH podrían alterar de forma activa la actividad de NOS.

Sumario de la invención

La presente invención se basa en el descubrimiento de que los seres humanos expresan dos metilarginasas funcionalmente activas, que se han denominado DDAHI y DDAHII. Se han clonado los polinucleótidos que codifican las isoformas DDAHI y DDAHII y se han estudiado los patrones de expresión de estas dos metilarginasas mediante transferencia de ARN. Estos experimentos pusieron de manifiesto que la DDAHI tiene una distribución tisular en seres humanos que es similar a la de la isoforma neuronal de la óxido nítrico sintasa (nNOS), mientras que la DDAHII se expresa mucho en tejidos vasculares que también expresan la isoforma endotelial (eNOS).

Además, se ha demostrado que la DDAHII se expresa en tejidos inmunes y se localiza en el cromosoma 6p21.3. Ese locus cromosómico se ha implicado en la susceptibilidad a varias enfermedades, incluyendo artritis reumatoide y diabetes mellitus insulinodependiente (IDDM) y la producción alterada de óxido nítrico se ha implicado en la patología de ambas enfermedades.

Los datos proporcionan pruebas de que la concentración de metilarginina está regulada de forma activa en células que expresan NOS y además, sugieren que existe un mecanismo de regulación de la NOS por el que se regulan específicamente isoformas diferentes de NOS ya que las concentraciones de metilarginina están moduladas por la acción de enzimas DDAH específicas.

Por lo tanto, la DDAHI y DDAHII proporcionan nuevas dianas para el aislamiento de sustancias que pueden modular específicamente la actividad de isoformas de NOS particulares u otras enzimas que utilizan arginina a través de la interacción específica con isoformas de DDAH particulares. Dichas sustancias pueden ser útiles en el tratamiento de enfermedades en las que están implicados niveles anormales de metilargininas y/o óxido nítrico.

Además se ha descubierto que la DDAHI y DDAHII humanas comparten una homología significativa con arginina desiminasas bacterianas. Las arginina desiminasas se han descrito solamente en organismos procariotas y en el eucariota primitivo Giardia intestinales. Las arginina desiminasas catalizan la hidrólisis de arginina a amoniaco y citrulina en una reacción que se parece mucho a la hidrólisis de metilarginina a metilamina y citrulina catalizada por DDAHI.

Se han aislado secuencias de DDAHI de tres especies de bacterias y una secuencia de arginina desiminasa de P. aeruginosa. Las enzimas codificadas por estas secuencias pueden expresarse a altos niveles y pueden recuperarse grandes cantidades de la enzima expresada. Por lo tanto, se ha identificado una fuente excelente de enzimas que pueden usarse para identificar compuestos capaces de modular la actividad de enzimas DDAH.

De acuerdo con la presente invención se proporciona por lo tanto un polinucleótido que:

La invención también proporciona:

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra un alineamiento de aminoácidos de DDAHI de rata y humana con DDAHII humana. Las secuencias de aminoácidos obtenidas de DDAHI humana y de rata y DDAHII humana se alinearon usando el programa clustal. Se indican las identidades de aminoácidos (*), sustituciones altamente conservativas (:) y sustituciones conservativas (.).

La Figura 2 muestra la expresión recombinante de DDAHII humana. Se resolvieron alícuotas de E. coli transfectadas con vector...

1. Un polinucleótido que:

2. Un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 1, que es una secuencia de ADN.

3. Un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 4.

4. Un polipéptido que tiene actividad metilarginasa y que comprende la secuencia expuesta en la SEC ID Nº: 4.

5. Un vector que incorpora un polinucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

6. Un vector de acuerdo con la reivindicación 5, que es un vector de expresión.

7. Una célula que alberga un vector de acuerdo con la reivindicación 5 ó 6.

8. Un proceso para la preparación de un polipéptido que tiene actividad metilarginasa, comprendiendo dicho proceso cultivar una célula hospedadora que alberga un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 6 en condiciones para proporcionar la expresión de dicho polipéptido y recuperar el polipéptido expresado.

9. Un anticuerpo capaz de unirse a un polipéptido que tiene actividad metilarginasa y que comprende la secuencia expuesta en la SEC ID Nº: 4, en el que el anticuerpo es capaz de discriminar entre un polipéptido de DDAHI y un polipéptido de DDAHII.

10. Un animal transgénico no humano que no es capaz de expresar una forma activa de una dimetilarginina dimetilaminohidrolasa II (DDAHII), en el que, en el animal transgénico, la secuencia polinucleotídica del locus del gen de la DDAHII se ha deleccionado o sustituido con la secuencia polinucleotídica de otro locus o de otro organismo, o en el que la secuencia codificante del gen de la DDAHII se ha alterado de modo que el polipéptido expresado no muestre actividad metilarginasa y en el que dicho animal no humano es un mamífero.

11. Un animal no humano de acuerdo con la reivindicación 10, que es un ratón.

12. Un método para identificar un modulador de la actividad y/o expresión de metilarginasa, comprendiendo dicho método:

13. Un polinucleótido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 4 o un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 6 para el uso en un método de tratamiento del cuerpo humano o animal mediante terapia.

14. Un polinucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 4 o un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 6 para el uso en un método de tratamiento de hiperlipidemia, insuficiencia renal, hipertensión, reestenosis después de angioplastia, aterosclerosis, complicaciones de insuficiencia cardiaca, esquizofrenia, esclerosis múltiple o cáncer.

15. Uso de un polinucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 4 o un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 6 para la fabricación de un medicamento para el uso en el tratamiento de hiperlipidemia, insuficiencia renal, hipertensión, reestenosis después de angioplastia, aterosclerosis, complicaciones de insuficiencia cardiaca, esquizofrenia, esclerosis múltiple o cáncer.

16. Una composición farmacéutica que comprende un polinucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 4 o un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 6 y un vehículo y/o diluyente farmacéuticamente aceptable.