Un procedimiento para cuantificar metabolitos de la vitamina D directamente en plasma o suero sanguíneos,

sin necesidad de purificación previa de los metabolitos de la vitamina D, que comprende las siguientes etapas: (a) adición de una cantidad apropiada de una serina proteasa con actividad endo y exoproteolítica a una muestra que contiene plasma o suero sanguíneos y la digestión de las proteínas de unión a vitamina D en el plasma o suero sanguíneos, hasta que ya no puedan unir más metabolitos de la vitamina D; (b) dilución de dicha muestra que contiene la serina proteasa, los metabolitos de la vitamina D y las proteínas plasmáticas o séricas digeridas usando un tampón de dilución, en el que la serina proteasa es sustancialmente inactiva; (c) proporción de una composición trazadora de la vitamina D, que está acoplada a una fase sólida; (d) proporción de un anticuerpo monoclonal contra los metabolitos pertinentes de la vitamina D; (e) combinación de la muestra con los metabolitos de la vitamina D, la fase sólida con la composición trazadora de la vitamina D y el anticuerpo monoclonal, y la realización durante un periodo de tiempo predeterminado de una reacción de unión competitiva entre los metabolitos de la vitamina D, el trazador de la vitamina D unido a una fase sólida y el anticuerpo monoclonal en un tampón de unión en el que la serina proteasa es sustancialmente inactiva; (f) separación de la fase sólida con el compuesto trazador de la vitamina D y del anticuerpo monoclonal unido del tampón de unión, y opcionalmente, el lavado de la fase sólida; y (g) determinación de la cantidad de anticuerpo monoclonal sobre la fase sólida, y cuantificación de los metabolitos de la vitamina D en el plasma o suero sanguíneos por correlación con muestras patrón

Determinación directa de la vitamina D en suero o plasma.

Campo de la invención

La invención se refiere a un procedimiento para la determinación cuantitativa de la vitamina D en suero o plasma.

Antecedentes de la invención

Los seres humanos pueden formar vitamina D₃ (colecalciferol) en la piel con la ayuda de la luz solar. La vitamina D₂ (ergocalciferol) se ingiere con la comida. A pesar de que las vitaminas D₂ y D₃ difieren ligeramente en sus cadenas laterales, tienen una actividad biológica idéntica. En circulación ambas se unen a la proteína de unión a la vitamina D (VDBP) y se metabolizan en el hígado a 25-hidroxivitamina D. La 25-hidroxivitamina D es la forma de almacenamiento en el cuerpo y el metabolito de la vitamina D con la concentración más alta en suero o plasma. Cuando es necesaria, se hidroxila en el riñón a 1α,25-hidroxivitamina D (la denominada hormona D) que es la forma biológicamente activa y que regula la absorción de calcio en el intestino, la mineralización de los huesos, la diferenciación de los osteoplastos, la síntesis de la matriz ósea y, entre otras, también las funciones neuromusculares. Incluso una pequeña deficiencia de menos de 15 ng de 25-hidroxivitamina D por ml de suero (37,5 nmol/l de 25-OH-Vit.D/l) provoca un incremento del nivel de parathormona y un incremento de la resorción ósea, debido a la reducción de la absorción de calcio (Chapuy MC y col. en J Clin Endocrinol Metab 1996; 81: 1129-33). La deficiencia en vitamina D es un factor de riesgo importante en la osteoporosis senil. Un diagnóstico temprano y el suplemento de vitamina D₂ permiten una prevención eficaz de las fracturas óseas. Una deficiencia severa de vitamina D de menos de 5 ng de 25-hidroxivitamina D por ml de suero (12,5 nmol/l de 25-OH-Vit.D/l) provoca raquitismo en niños y osteomalacia en adultos (Scharla y col. Exp Clin Endocrinol. Diabetes, 1996, 104:289-292). El exceso de vitamina D debido a una sobredosificación provoca hipercalcemia. Durante el invierno, en Alemania aproximadamente un tercio de la población mayor de 50 años sufre de deficiencia en vitamina D debido a la falta de luz (Scharla y col., Osteoporose Int. 1998; 8 (Supplement 2):S7-S12). La gente más joven también puede sufrir de deficiencia en vitamina D, debido a enfermedades gastrointestinales, disfunción hepática, una mala adsorción, o un metabolismo acelerado inducido por fármacos, por ejemplo, provocado por antiepilépticos.

Las técnicas de laboratorio convencionales para la determinación de la 25-hidroxivitamina D en suero y plasma son muy laboriosas (Tanner y col. (1988), J. Assoc, of Analyt. Chem., 17, 607-710). Además, la patente de EE.UU. 5.981.779 (Holick y col.), el documento WO 89/01631 y la EP 0 583 945 (DeLuca y col.) enseñan una prueba para vitamina D basada en la unión a la VDBP. Para conseguir eso, en primer lugar se deben extraer los metabolitos de la vitamina D del plasma o suero usando disolventes orgánicos, y a continuación se deben purificar por cromatografía. El documento WO 99/67211 (Armbruster y col.) enseña la preparación de una muestra que supone la precipitación de las proteínas plasmáticas y séricas con etanol. A continuación el precipitado de proteínas se extrae por centrifugación y el sobrenadante etanólico, que comprende los metabolitos solubles de la vitamina D, se usa en el ensayo de unión. El documento EP 0 753 743 (Hollis) enseña la preparación de la muestra de plasma o suero usando precipitación con peryodato. A continuación se lleva a cabo la cuantificación de los compuestos de vitamina D en el sobrenadante exento de proteínas. El documento WO 2004/063704 (Diasorin Inc.) describe un procedimiento de ensayo de una muestra de sangre o suero para la determinación de la presencia de 25-hidroxivitamina D que comprende una reducción del pH de la muestra a 5,5 o inferior para disociar la 25-hidroxivitamina D de las proteínas de unión a vitamina D. Las proteínas de unión a vitamina D no se eliminan antes de la cuantificación de los metabolitos de la vitamina D en la muestra. El documento WO 02/46746 (Immunodiagnostic Systems Ltd.) se refiere a un procedimiento para medir la 25-hidroxivitamina D en el que se añade un agente de desplazamiento no competitivo, tal como la warfarina, para llevar a cabo la separación del analito en la muestra de las proteínas de unión a vitamina D. La cuantificación de los metabolitos de la vitamina D en la muestra se lleva a cabo en presencia de proteínas de unión a vitamina D y del agente de desplazamiento añadido. Los documentos WO 03/023391 (Immundiagnostik AG) y DE 10144 905 (Armbruster y col.) describen un procedimiento para la determinación de la vitamina D directamente en plasma o suero en el que se añade un compuesto salicílico soluble al suero o plasma para liberar la 25-hidroxivitamina D de la VDBP. A continuación se determina directamente la cantidad de 25-hidroxivitamina D en plasma o suero usando anticuerpos.

Los procedimientos de preparación de muestras mencionados anteriormente son laboriosos o tienden a generar errores, o ambos. Es el objeto de la presente invención proporcionar un procedimiento simple y fiable para la determinación cuantitativa directa de la 25-hidroxivitamina D en suero o plasma.

Breve descripción de la invención

Este problema se ha resuelto mediante el procedimiento según la reivindicación 1. Las formas de realización preferidas del procedimiento se describen en las reivindicaciones dependientes.

Según la presente invención, el procedimiento directo para la determinación cuantitativa de los metabolitos de la vitamina D en plasma o suero sanguíneos por análisis de unión competitiva, sin la necesidad de la purificación de los metabolitos de la vitamina D del plasma o suero sanguíneos, incluye las siguientes etapas: (a) adición de una cantidad apropiada de una serina proteasa con actividad endo y exoproteolítica tal como la proteinasa K a una muestra que contiene plasma o suero sanguíneos y la digestión de las proteínas de unión a vitamina D en el plasma o suero sanguíneos, hasta que ya no se puedan unir más metabolitos de la vitamina D; (b) dilución de la muestra que contiene la serina proteasa, los metabolitos de la vitamina D y las proteínas plasmáticas o séricas digeridas usando un tampón de dilución, en el que la serina proteasa es sustancialmente inactiva; (c) proporción de una composición trazadora de la vitamina D, que está acoplada a una fase sólida; (d) proporción de un anticuerpo, preferentemente un anticuerpo monoclonal contra los metabolitos pertinentes de la vitamina D, en el que dicho anticuerpo es sustancialmente resistente a la actividad endoproteolítica de la serina proteasa usada, y (e) combinación de la muestra con los metabolitos de la vitamina D (analito), la fase sólida con el compuesto trazador de la vitamina D y el anticuerpo monoclonal durante un periodo predeterminado, y la realización durante un periodo de tiempo determinado de una reacción de unión competitiva del metabolito de la vitamina D y el trazador de la vitamina D sobre el anticuerpo monoclonal en un tampón de unión, en el que la serina proteasa es esencialmente inactiva y no se puede producir una unión inespecífica entre la vitamina D y las proteínas séricas remanentes, y (f) la separación de la fase sólida con el compuesto trazador de la vitamina D y del anticuerpo monoclonal opcionalmente unido del tampón de unión, y opcionalmente, el lavado de la fase sólida; y (g) determinación de la cantidad de anticuerpo monoclonal sobre la fase sólida, y (h) determinación de la cantidad de metabolito de la vitamina D en el plasma o suero sanguíneos usando datos comparativos.

En una realización preferida del procedimiento, el análisis de unión se lleva a cabo a un valor de pH entre 3,0 y 10,0 en presencia del 0,1 al 5,0% (p/v) de gelatina, 1 a 10 mmol/l de EDTA o EGTA, y opcionalmente inhibidores de la serina proteasa, y del 0,005 al 0,050% (p/v) de β-mercaptoetanol. El anticuerpo usado en las etapas (d) y (f) también puede ser una mezcla de anticuerpos monoclonales, que se unen específicamente a la 25-hidroxivitamina D₃ y 25-hidroxivitamina D₂, respectivamente. En una realización de la invención, el anticuerpo monoclonal se puede unir a la 25-hidroxivitamina D₃ o a la 25-hidroxivitamina D₂ o a ambas. En una realización diferente del procedimiento de la invención, el anticuerpo monoclonal se puede unir a la 1α,25-dihidroxivitamina D₂ o a la 1α,25-dihidroxivitamina D₃...

1. Un procedimiento para cuantificar metabolitos de la vitamina D directamente en plasma o suero sanguíneos, sin necesidad de purificación previa de los metabolitos de la vitamina D, que comprende las siguientes etapas:

(a) adición de una cantidad apropiada de una serina proteasa con actividad endo y exoproteolítica a una muestra que contiene plasma o suero sanguíneos y la digestión de las proteínas de unión a vitamina D en el plasma o suero sanguíneos, hasta que ya no puedan unir más metabolitos de la vitamina D;

(b) dilución de dicha muestra que contiene la serina proteasa, los metabolitos de la vitamina D y las proteínas plasmáticas o séricas digeridas usando un tampón de dilución, en el que la serina proteasa es sustancialmente inactiva;

(c) proporción de una composición trazadora de la vitamina D, que está acoplada a una fase sólida;

(d) proporción de un anticuerpo monoclonal contra los metabolitos pertinentes de la vitamina D;

(e) combinación de la muestra con los metabolitos de la vitamina D, la fase sólida con la composición trazadora de la vitamina D y el anticuerpo monoclonal, y la realización durante un periodo de tiempo predeterminado de una reacción de unión competitiva entre los metabolitos de la vitamina D, el trazador de la vitamina D unido a una fase sólida y el anticuerpo monoclonal en un tampón de unión en el que la serina proteasa es sustancialmente inactiva;

(f) separación de la fase sólida con el compuesto trazador de la vitamina D y del anticuerpo monoclonal unido del tampón de unión, y opcionalmente, el lavado de la fase sólida; y

(g) determinación de la cantidad de anticuerpo monoclonal sobre la fase sólida, y cuantificación de los metabolitos de la vitamina D en el plasma o suero sanguíneos por correlación con muestras patrón.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la serina proteasa es proteinasa K.

3. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que el anticuerpo monoclonal se une a uno o más de 25-hidroxivitamina D₃, 25-hidroxivitamina D₂, 1α,25-dihidroxivitamina D₂ y 1α,25-dihidroxivitamina D₃.

4. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el metabolito de la vitamina D medido directamente se selecciona del grupo constituido por 25-hidroxivitamina D₂, 25-hidroxivitamina D₃, 1α,25-dihidroxivitamina D₂ y 1α,25-dihidroxivitamina D₃.

5. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el ensayo de unión a proteínas es uno de ELISA (ensayo inmunoabsorbente unido a enzimas), RIA (radioinmunoensayo), FIA (inmunoensayo de fluorescencia), LIA (inmunoensayo de luminiscencia), o ILMA (ensayo inmunoluminométrico).

6. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la digestión de la proteína de la etapa a) se lleva a cabo dentro de un intervalo de pH de 6,0 a 10 en presencia de 0,1 a 10 mg/ml de uno o más agentes desnaturalizantes de proteínas y agentes de liberación de vitamina D seleccionados entre ácido salicílico, ácido toluensulfónico, ácidos naftalensulfónicos, ácidos anilinonaftalensulfónicos, dodecilsulfato sódico, warfarina.

7. Kit de prueba para cuantificar metabolitos de la vitamina D directamente en plasma o suero sanguíneos, que comprende al menos

(i) uno o más anticuerpos específicos de metabolitos de la vitamina D,

(ii) un trazador de la vitamina D que está acoplado a una fase sólida,

(iii) proteinasa K en forma de disolución madre,

(iv) un tampón para uso con la proteinasa K que comprende uno o más agentes desnaturalizantes de proteínas y agentes de liberación de vitamina D seleccionados entre ácido salicílico, ácido toluensulfónico, ácidos naftalensulfónicos, ácidos anilinonaftalensulfónicos, dodecilsulfato sódico, warfarina;

(v) un tampón para uso con el ensayo de unión competitivo que comprende adicionalmente un inhibidor de la proteinasa K.

8. El kit de prueba de la reivindicación 7, en el que el tampón (v) comprende EGTA de 0,1 a 50 mM y del 0,5 al 10% (p/p) de compuestos salicílicos y sus derivados.

9. El kit de prueba de la reivindicación 7, en el que el tampón (v) comprende agentes desnaturalizantes y agentes de liberación de vitamina D en una cantidad para obtener una concentración final de 0,1 a 10 mg/ml.