CIRCOVIRUS ATENUADOS.

Un virus de la anemia del pollo (VAP) atenuado aislado capaz de replicación celular y que tiene una secuencia de ácido nucleico seleccionado del grupo constituido por las SEC ID Nº 3,

5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 y 25

Circovirus atenuados.

Campo técnico

La presente invención se refiere a virus atenuados, composiciones de vacunas virales, particularmente circovirus atenuados en forma de virus de la anemia del pollo.

Técnica anterior

El virus de la anemia del pollo (VAP) es un miembro de la familia Circoviridae. La familia circoviridae incluye una serie de virus vegetales y animales que se caracteriza por la posesión de un genoma de ADN circular, monocatenario y de sentido negativo. Existe una similitud mínima en la secuencia y organización genómica entre el VAP y los otros circovirus animales caracterizados. El virus de la enfermedad del pico y las plumas de las psitácidas (VEPPP), circovirus de las palomas, circovirus de las palomas y circovirus porcino (CVP) 1 Y 2. Recientemente se han identificado virus TT (TTV) en huéspedes humanos y otras especies en forma de un grupo heterogéneo de virus de ADN circular, monocatenario y de sentido negativo. El análisis de la secuencia de este grupo de virus ha demostrado la mayor homología global con el VAP y otros investigadores han propuesto recientemente la clasificación de TTV, SANBAN, YONBAN, TLMV ((minivirus similares al TTV) y los virus VAP como Paracircoviridae, no obstante, la filogenia sigue siendo un área de revisión activa. La mayor homología de secuencia con el VAP se observa en la región no codificadora y entre el marco de lectura abierto (ORF2) del TTV y el VP2 del VAP. El alto nivel de conservación de secuencia entre el VAP y el TTV sugiere que el VP2 puede desempeñar un papel crucial en la infección vírica y la patogenia.

El VAP sólo codifica tres proteínas, con ORF superpuestos en tres marcos. El ORF3 codifica la mayor proteína de la cápside VP1 de 45-52 kDa, el ORF2 codifica la VP3 de 11-13 kDa que ha mostrado actividad apoptótica en las líneas celulares transformadas y el ORF1 codifica una proteína no estructural VP2 de 28 kDa con función desconocida. La VP2 se expresa a niveles apenas detectables durante la infección, pero se ha demostrado que es esencial para la infección vírica y la replicación en las células. El bajo nivel de expresión de la VP2 es consistente con una proteína reguladora no estructura implicada en la replicación y la infección viral.

La patogenia del VAP se caracteriza por inmunosupresión y pancitopenia producida por panmieloftisis y depleción de timocitos. La inmunosupresión tiene como resultado mayores índices de morbididad y mortalidad asociados con co-infecciones y fallos de vacunación en pollos infectados por el VAP. La infección por el VAP es directamente citotóxica para dos poblaciones de células T distintas del timo y el bazo. La infección del timo implica precursores linfoblásticos inmaduros, mientras que la infección esplénica es de linfocitos T maduros que están altamente activados. Existe un segundo componente indirecto de la inmunosupresión que se encuentra en las células efectoras inmunitarias no infectadas. Se han documentado reducciones en las funciones de los macrófagos y las CPA y las respuestas antigénicas de las células B. Los perfiles limitados de citoquinas de células infectadas sugieren una base de inmunosupresión indirecta generalizada. Existe una reducción en el índice de estimulación de interleucina 2 (IL-2), interferón gamma (IFN?), linfocitos, la actividad del factor de crecimiento de las células T y los niveles del receptor Fc en linfocitos de aves infectadas. La base molecular de la modulación vírica de los perfiles de citoquinas y la inmunosupresión indirecta se desconoce.

Las comparaciones preliminares de la secuencia de la VP2 del VAP con las secuencias disponibles en la base de datos Genbank han sugerido la similitud con una serie de PTPasas receptoras eucarióticas (R-PTPasa alfa). Las búsquedas en bases de datos han identificado precursores de la R-PTPasa alfa en placenta humana, ratas, ratones y pollos como homólogos a la secuencia de la VP2 del VAP. La fosforilación reversible de proteínas es universal en la regulación de procesos celulares, entre los que se incluyen el metabolismo, la regulación génica, el control del ciclo celular, la organización del citoesqueleto y la adhesión celular. La familia de las PTPasas es considerablemente diversa e incluye proteínas transmembrana similares al receptor eucariótico y proteínas citosólicas, así como PTPasas bacterianas, tales como la PTPasa YopH de Yersinia patógena y una PTPasa VH1 que se encuentra en el virus Vaccinia, un miembro de la familia Poxviridae. Durante la infección por el virus Vaccinia, la proteína VH1 bloquea la señalización del interferón ? y, de este modo, evade la respuesta inmunitaria frente a la infección vírica. El papel de la PTPasa VH1 en la infección, aunque actualmente es la única PTPasa vírica con una función in vivo caracterizada, destaca la posibilidad de que las PTPasas codificadas en el virus estén implicadas en mecanismos de la invasión inmunitaria y la persistencia del virus.

Los productores de aves comerciales requieren una vacuna contra el virus de la anemia del pollo (VAP) que reduzca las pérdidas económicas en las que incurren por las infecciones tanto clínicas como subclínicas. La eliminación de la enfermedad subclínica en aves adultas asociada con la infección por VAP requiere la superación de la inmunosupresión debido a la infección. La infección por el VAP tiene gran importancia económica en bandadas de pollos en engorde. Las infecciones tanto clínica como subclínica ejercen un gran impacto sobre el rendimiento y la rentabilidad del pollo de engorde comercial. Aunque la infección clínica produce una reducción más marcada de los parámetros de rendimiento, la infección subclínica es responsable de un mayor grado de pérdida económica que es de mayor incidencia. Existe una gran necesidad de una vacuna adecuada para gallinas menores de un año, pollos de engorde y pollos de cría. Tal vacuna puede administrarse a las aves en el momento de la puesta y, por tanto, debe ser segura en caso de transmisión vertical a los embriones.

El desarrollo de una vacuna contra el VAP tiene aplicaciones internacionales. El virus de la anemia del pollo (VAP) tiene una distribución mundial sobre la base de la investigación sexológica y es endémico en bandadas SPF y de pollos para comercialización, con la excepción de las bandadas SPF australianas. Entre los países en los que se han caracterizado aislamientos del VAP y se ha publicado las secuencias completas de su genoma se incluyen Alemania, Reino Unido, EE.UU., Japón, Australia y Países Bajos. Todos los aislamientos se clasifican dentro de un único serotipo basado en la reactividad cruzada en las pruebas de inmunofluorescencia y neutralización utilizando antisuero policlonal. La conservación de la secuencia del genoma es una característica clave de todos los aislamientos del VAP. Todos los aislamientos en campo demuestran una patogenicidad equivalente en la infección experimental y cualquier variación en la morbididad y la gravedad de la enfermedad con la exposición al VAP se atribuye a una serie de factores epidemiológicos que interaccionan. La dosis de virus es el determinante clave de la gravedad de la enfermedad inducida por el VAP en el campo. Cabe esperar que las vacunas con microorganismos vivos atenuados desarrolladas a partir de un aislamiento cualquiera sean protectoras en bandadas de aves de corral internacionalmente.

Una cepa del VAP atenuada debería ser infecciosa, aunque con una patogenicidad reducida. La enfermedad clínica se caracteriza mejor en la literatura en aves infectadas al día de edad. La enfermedad clínica en polluelos infectados al día de edad se caracteriza por debilidad, depresión, atrofia y anemia. A los 7 días de la infección se produce una anemia peraguda transitoria pero grave debido a la destrucción de las células eritroblastoides e inmunodeficiencia por depleción de linfocitos corticales. La hipoplasia intensa de la médula ósea, la atrofia linfoide y la trombocitopenia se ponen de manifiesto a los 14-21 días de la infección. Las hemorragias petequiales y equimóticas se desarrollan por una coagulopatía primaria. La inmunosupresión es una característica significativa de la enfermedad inducida por el VAP y las infecciones secundarias son frecuentes. Las aves afectadas por el VAP presentan una mayor incidencia de edema maligno, dermatitis gangrenosa, colibacilosis y aspergilosis pulmonar. La fase de recuperación se extiende desde los 14 a los 35 días después de la infección. Durante la recuperación, la eritrocitopoyesis precede a la granulocitopoyesis. A los 16 días de la infección existe una elevada proporción de eritrocitos, trombocitos y granulocitos...

1. Un virus de la anemia del pollo (VAP) atenuado aislado capaz de replicación celular y que tiene una secuencia de ácido nucleico seleccionado del grupo constituido por las SEC ID Nº 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 y 25.

2. El virus de acuerdo con la reivindicación 1 que tiene la secuencia de ácido nucleico de SEC ID Nº 23.

3. El virus de acuerdo con la reivindicación 1 que tiene la mutación-mut D 169 G.

4. Una composición de vacuna contra el VAP que comprende un VAP atenuado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 junto con un portador o diluyente adecuado.

5. Una proteína vírica 2 (VP2) del VAP mutante aislado que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por la SEC ID Nº: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 y 26.

6. La VP2 del VAP de acuerdo con la reivindicación 5 que tiene la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID Nº 24.

7. Un cebador de ácido nucleico para introducir una mutación en la VP2 de VAP que tiene una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo constituido por ctgcgcgaaCgctcgcgttcccacgctaag o aacgcgagcGttcgcgcagccacacagcga que introduce la mut C87R cgctaagatcAgcaactgcg o cgcagttgcTgatcttagcgtg que introduce la mut C95S, atctgcaacAgcggacaattc o attgtccgcTgttgcagatcttag que introduce la mut C97S, ctgcggacaattcGgaaaacactgg o cagtgttttcCgaattgtccgcag que introduce la R101G, cagaaaaTactggtttcaagaatgtgccggac o gaaaccagtAttttctgaattgtccgcag que introduce H103Y, ctgcgacccctcGgagtacaggg o ccctgtactcCgaggggtcgcaggatcgc que introduce R129G, cgagtacCgggtaagcgagctaaaag o cgcttacccGgtactcggagg introducing mut Q131P, ccgaacGgcGCgGCggtgtataag o atacaccGCcGCgcCgttcggggtc que introduce la mut R/K/K150/151/152G/A/A, taagatggcaagGcgGgctcgcagacc o tgcgagcCcgCcttgccatc que introduce la mut D/E 161/162 G/G, gacgagcCcgcagaccgagag o ggcctctcggtctgcgGgctcgtc que introduce la mut L163P, gagaggccgGttttacgccttcag o gcgtaaaaCcggcctctcggtc que introduce la mut D169G y ctgcggacaattcagaGaacactggtttc o gaaaccagtgttCtctgaattgtccgcag que introduce la mut K102E.

8. El cebador de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 7 que es gagaggccgGttttacgccttcag o gcgtaaaaCcggcctctcggtc que introduce mut D169G.

9. Uso del virus de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en la fabricación de una vacuna para conferir inmunidad en un animal contra una infección por circovirus.

10. Uso del cebador de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 7 u 8 en la fabricación de una vacuna para conferir inmunidad en un animal contra una infección por circovirus.

11. Un procedimiento para producir un circovirus atenuado que comprende:

(a) inocular el cebador de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 7 u 8 en el saco vitelino de un huevo embrionado;

(b) permitir que el circovirus se replique a partir de la molécula de ácido nucleico aislado; y

(c) recolectar el circovirus del huevo.