Procedimiento de obtención de una cepa mutante de bacteria láctica que posee una postacidificación más débil que la cepa madre de la que procede,

caracterizado porque se introduce en el ADN genómico de dicha cepa madre una mutación del codón que codifica la histidina fosforilable por HPr(His-P) del dominio IIA de la lactosa permeasa, induciendo dicha mutación el reemplazo de dicha histidina por un aminoácido no fosforilable

Cepas mutantes de bacterias lácticas que poseen una lactosa permeasa no fosforilable.

La presente invención se refiere al campo de la fermentación láctica. Más precisamente, esta invención se basa en nuevos mutantes de Streptococcus thermophilus que expresan una lactosa permeasa mutante cuya actividad de transporte de lactosa está modificada. Estas cepas, y los fermentos que la comprenden, pueden usarse para la obtención de productos lácteos fermentados que poseen buenas propiedades de conservación.

Los yogures se obtienen tradicionalmente mediante fermentación de la leche con una asociación de diferentes bacterias lácticas, elegidas entre las cepas de Streptococcus thermophilus y de Lactobacillus bulgaricus. A lo largo de de la fermentación, que se efectúa a una temperatura de aproximadamente 40 a 45ºC, estas bacterias usan principalmente la lactosa como sustrato energético y producen ácido láctico que conlleva la coagulación de la leche; cuando el pH alcanza un valor de aproximadamente 4,8 a 4,5, se pone fin a esta etapa de fermentación (igualmente denominada "acidificación") enfriando el producto. Se mantiene éste a continuación en frío durante la continuación del proceso de fabricación y acondicionamiento y hasta su consumo.

Sin embargo, el enfriamiento no detiene completamente la fermentación láctica; incluso cuando el producto se mantiene a 4ºC, se observa un aumento progresivo de su acidez a lo largo del tiempo.

Este fenómeno, conocido con el nombre de postacidificación, es responsable de una degradación de las calidades organolépticas del producto durante su conservación.

La postacidificación es esencialmente el resultado del uso, por las bacterias, de la lactosa restante en el producto al término de la etapa de acidificación controlada. Para evitarla, se ha propuesto usar cepas de bacterias lácticas que no fermenten la lactosa o muy poco.

Las enzimas esenciales para la fermentación de la lactosa en Streptococcus thermophilus y Latobacillus bulgaricus están codificadas por el operón lactosa, que contiene el gen lacS que codifica la lactosa permeasa y el gen lacZ que codifica la ß-galactosidasa. Estas proteínas son responsables respectivamente del transporte y de la hidrólisis de la lactosa. Por tanto, se ha propuesto, para obtener cepas no postacidificantes de bacterias lácticas, producir variantes artificiales o seleccionar mutantes naturales en los que esté afectada la actividad de al menos una de estas enzimas.

La patente EP 1078074 (Compagnie Gervais Danone) se refiere a mutantes de L. bulgaricus deficientes en actividad de ß-galactosidasa, que comprenden una mutación no codificante en al menos uno de los genes del operón lactosa. Esta patente describe más específicamente un mutante cuyo análisis de secuencia exhibe dos mutaciones puntuales: una que introduce un codón de terminación en el gen de ß-galactosidasa, que induce la incapacidad de ese mutante de usar la lactosa; la otra mutación induce un cambio de aminoácido al nivel del gen de permeasa (Lys rightarrow Asn en posición 122); el documento EP 1078074 no reseña ningún efecto de esta mutación sobre el fenotipo del mutante.

El documento WO0188150 describe mutante de una cepa de Lactobacillus. Estos mutantes son incapaces de usar la lactosa, pero conservan la capacidad de expresar ß-galactosidasa. El documento WO0188150 no precisa la naturaleza ni la posición de la mutación referida, e indica simplemente que puede situarse en uno de los genes estructurales del operón lactosa, por ejemplo la permeasa, o en una región de regulación del operón lactosa, o en un gen que interviene en el control de la expresión del operón lactosa.

Los mutantes descritos en los documentos citados anteriormente tienen en común la propiedad de ser completamente incapaces de usar la lactosa. Sólo pueden crecer en leche si ésta se complementa con un azúcar distinto de lactosa, generalmente glucosa. Las propiedades de acidificación y postacidificación de estos mutantes están controladas por la cantidad de glucosa añadida.

Con el fin de proporcionar una alternativa a estos mutantes, los inventores han investigado si era posible obtener cepas de bacterias lácticas que tuvieran por una parte una capacidad de usar la lactosa a lo largo de su crecimiento comparable a la de las cepas salvajes, y por otra parte una aptitud limitada de usar la lactosa a lo largo de la fase estacionaria, de forma que se redujese o anulase el fenómeno de postacidificación. Con este objetivo, se han interesado en la posibilidad de actuar sobre la regulación del transporte de lactosa en las células de bacterias lácticas, y especialmente en células de S. thermophilus.

El transporte de lactosa extracelular en las células de S. thermophilus se hace a través de la lactosa permeasa LacS. Este transporte de lactosa se hace en simporte con un protón o en antiporte con la galactosa intracelular resultante de la degradación de lactosa.

El transporte de lactosa depende de dos fenómenos: por una parte, el estado de fosforilación de la lactosa permeasa y, por otra parte, la expresión del gen lacS, que codifica esta lactosa permeasa. Se detallan estos dos aspectos a continuación.

Fosforilación de la lactosa permeasa

La proteínas LacS está compuesta por un dominio de translocación y un dominio de regulación (IIA). Estos dominios contienen diferentes residuos de histidina, cuya fosforilación interviene en la regulación del transporte de lactosa. Especialmente, el dominio IIA es fosforilable en la histidina 552. Esta fosforilación se efectúa mediante la proteína HPr (proteína vehículo fosforada que contiene histidina), ella misma previamente fosforilada.

La HPr puede fosforilarse:

Sólo la forma de HPr fosforilada en histidina permite la fosforilación de la lactosa permisa en la histidina 552.

Se ha observado en un modelo in vitro de proteoliposomas que reproduce el entorno de membrana de la proteína LacS y su fosforilación por HPr(His-P), que esta fosforilación no tiene efecto sobre el transporte de lactosa en simporte con un protón (Gunnewijk y Poolman, 2000a), pero aumenta por un factor de aproximadamente 2 el flujo de intercambio lactosa/galactosa.

Transcripción del gen lacS

La transcripción del operón lactosa está inducida por el crecimiento en medio lactosado. El promotor de los genes lacS y Z contiene un sitio cre (elemento sensible a catabolito) que permite una regulación por CcpA: la CcpA reprime la expresión de lacS y lacZ. La CcpA tiene al contrario un efecto activador sobre la transcripción del gen que codifica la lactato deshidrogenasa (van den Bogaard et al., 2000).

La forma HPr(Ser-P) es capaz de interaccionar con CcpA. Estas proteínas juntas van a permitir formar un complejo con el sitio cre, lo que conlleva una represión de la transcripción del gen lacS (Jones et al., 1997).

Se ha observado (Gunnewijk y Poolman, 2000b) que la forma HPr(Ser-P) es dominante al inicio de la fase exponencial de crecimiento de los cultivos de S. thermophilus y disminuye a lo largo de ésta, mientras que la forma HPr(His-P) aparece a lo largo de la fase exponencial y es máxima en la entrada en la fase estacionaria. El paso de HPr(Ser-P) a HPr(His-P) se realiza en paralelo a la disminución de lactosa y al aumento de galactosa en el medio de cultivo, y a un gran aumento de la expresión de lactosa permeasa.

Así, el estado de fosforilación de la proteína HPr parece desempeñar un papel en la regulación del transporte de lactosa, compensando la disminución de lactosa en el medio, mediante por una parte el nivel de expresión de la proteína LacS y por otra parte la regulación de su actividad.

Basándose en las observaciones reseñadas anteriormente, Gunnewijk y Poolman han propuesto el modelo siguiente: cuando la lactosa es abundante en el medio, se reprime la expresión del gen lacS por el complejo HPr(Ser-P)/CcpA. A lo largo de la fermentación, la acumulación de galactosa en el medio y la disminución...

1. Procedimiento de obtención de una cepa mutante de bacteria láctica que posee una postacidificación más débil que la cepa madre de la que procede, caracterizado porque se introduce en el ADN genómico de dicha cepa madre una mutación del codón que codifica la histidina fosforilable por HPr(His-P) del dominio IIA de la lactosa permeasa, induciendo dicha mutación el reemplazo de dicha histidina por un aminoácido no fosforilable.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la cepa madre es una cepa de Streptococcus thermophilus y porque esta mutación introduce un codón de alanina en lugar del codón de histidina 552.

3. Cepa de bacteria láctica apta para obtenerse mediante un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2.

4. Cepa de bacteria láctica según la reivindicación 3, caracterizada porque posee una actividad de ß-galactosidasa.

5. Cepa de bacteria láctica según la reivindicación 4, caracterizada porque se trata de la cepa mutante de S. thermophilus depositada el 10 de mayo de 2004 en la CNCM con el número I-3213.

6. Fermento láctico que comprende al menos una cepa de bacterias según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5.

7. Fermento láctico según la reivindicación 6, caracterizado porque comprende al menos una cepa mutante de S. thermophilus según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, asociada al menos a una cepa de L. bulgaricus.

8. Procedimiento de preparación de un producto lácteo fermentado, que comprende una etapa a lo largo de la cual se fermenta leche con la ayuda de un fermento láctico según la reivindicación 6 o la reivindicación 7.

9. Producto lácteo fermentado apto para obtenerse mediante un procedimiento según la reivindicación 8.

10. Producto lácteo fermentado según la reivindicación 9, caracterizado porque dicho producto se elige entre los yogures, las leches fermentadas, las bebidas fermentadas, los kéfires, los quesos y las leches infantiles fermentadas.