Una molécula de ácido nucleico aislado seleccionada entre el grupo constituido por:

(a) una molécula de ácido nucleico aislado que codifica un fragmento de la SEC DE ID Nº: 2;

(b) una molécula de ácido nucleico aislado que se hibrida con una molécula de ácido nucleico que comprende el complemento de la SEC DE ID Nº: 1 en condiciones de elevada restricción; y

(c) una molécula de ácido nucleico aislado con al menos un setenta y cinco por ciento de homología de la secuencia con la SEC DE ID Nº: 1;

en la que dicha molécula de ácido nucleico aislado codifica un polipéptido que bloquea la inhibición del crecimiento axonal que está mediada por el receptor NOGO de la SEC DE ID Nº 2

Bloqueo del crecimiento axonal mediado por el receptor de Nogo.

Referencia cruzada con solicitudes relacionadas

Esta aplicación está relacionada con las Solicitudes de Patente Provisional de los Estados Unidos 60/175.707 presentada el 12 de junio de 2000; 60/207.366 presentada el 26 de mayo de 2000 y 60/236.378 presentada el 29 de septiembre de 2000.

Financiación del gobierno de los Estados Unidos

Esta invención se realizó parcialmente con la financiación del gobierno con la beca 5-R01-NS33020 del National Institute of Health.

Campo de la invención

Esta divulgación se refiere específicamente a novedosos genes humanos y de murino que codifican un receptor de la proteína Nogo, siendo capaz este receptor de regular el crecimiento axonal. Estos genes del receptor de Nogo se expresan selectivamente en los axones y las dendritas de las neuronas en el sistema nervioso central durante el crecimiento axonal. La divulgación se refiere también a las composiciones y los procedimientos para el bloqueo selectivo de la inhibición mediada por el receptor de Nogo del crecimiento axonal bloqueando la interacción de Nogo con el receptor de Nogo. El bloqueo de la interacción de Nogo con su receptor da como resultado un bloqueo de los efectos inhibidores de Nogo sobre el crecimiento axonal produciendo un posterior aumento en el crecimiento axonal.

Antecedentes de la invención

Los axones y las dendritas de las neuronas son largas extensiones celulares procedentes de las neuronas. En el extremo distal de un axón o neurita que se extiende hay una región especializada, conocida como cono de crecimiento. Los conos de crecimiento son responsables de detectar el entorno local y del movimiento hacia la célula diana de la neurona. Los conos de crecimiento tienen forma de mano, con varios filopodios largos que se adhieren diferencialmente a las superficies en el embrión. Los conos de crecimiento pueden ser sensibles a varios atractores de guiado, por ejemplo, adhesividad superficial, factores de crecimiento, neurotransmisores y campos eléctricos. La guía de crecimiento en los conos depende de diversos tipos de moléculas de adhesión, señales intercelulares, así como de factores que estimulan e inhiben los conos de crecimiento. El cono de crecimiento localizado en el extremo de una neurita en crecimiento avanza a diversas velocidades, pero normalmente a la velocidad de uno a dos milímetros por día. El cono está constituido por una expansión amplia y plana, con numerosas microespigas o filopodios largos que se expanden en forma de espigas. Estos filopodios están continuamente activos. Aunque algunos filopodios se retraen hacia el interior del cono de crecimiento, otros continúan alargándose a través del sustrato. Los alargamientos entre diferentes filopodios forman lamelipodios.

El cono de crecimiento puede explorar el área que se encuentra delante de sí y hacia cualquier lado con sus lamelipodios y filopodios. Cuando un alargamiento entra en contacto con una superficie que es desfavorable, se retrae. Cuando un alargamiento entra en contacto con una superficie favorable, continúa extendiéndose y puede manipular el cono de crecimiento moviéndose en esta dirección. Por tanto, el cono de crecimiento puede guiarse por pequeñas variaciones en las propiedades superficiales de los sustratos. Cuando el cono de crecimiento alcanza una célula diana apropiada, se crea una conexión sináptica.

Las neuronas dañadas no se regeneran en el sistema nervioso central (SNC) tras lesión debida a traumatismo y a enfermedad. La ausencia de regeneración axonal tras la lesión se puede atribuir a la presencia de inhibidores del crecimiento axonal. Estos inhibidores se asocian predominantemente con la mielina y constituyen una barrera importante a la regeneración. Los inhibidores del crecimiento axonal están presentes en la mielina derivada del SNC y en la membrana plasmática de los oligodendrocitos, que sintetiza la mielina en el SNC (Schwab y col., (1993) Ann. Rev. Neurosci. 16, 565-595).

La mielina del SNC está en una extensión elaborada de la membrana celular de los oligodendrocitos. Un único oligodendrocito mielina un máximo de treinta segmentos axonales diferentes del SNC. Las extensiones de la membrana de los oligodendrocitos se envuelven alrededor de los axones de manera concéntrica para formar la vaina de mielina. La mielina madura firmemente compactada está constituida por capas paralelas de lípidos bimoleculares yuxtapuestos a las capas de la proteína hidratada. La síntesis de la mielina activa comienza en el útero y continúa durante los dos primeros años de la vida humana. Una síntesis más lenta continúa durante la infancia y la adolescencia, mientras que la renovación de la mielina madura continúa a una velocidad más lenta durante toda la vida adulta. Las formas de la mielina en desarrollo y maduras son susceptibles de lesión procedente de enfermedad o trauma físico dando como resultado la degradación de los axones que rodean la mielina.

Los inhibidores asociados a la mielina parecen ser un contribuyente principal al fracaso de la regeneración axonal en el SNC in vivo tras una interrupción de la continuidad axonal, mientras que otros inhibidores del crecimiento axonal no asociados a mielina en el SNC pueden jugar un papel menos importante. Estos inhibidores bloquean la regeneración axonal tras lesión neuronal debida a traumatismo, apoplejía, o infección vírica.

Se han caracterizado numerosos inhibidores del crecimiento axonal derivados de mielina (véase, para la revisión, David y col., (1999) documento WO995394547; Bandman y col., (1999) Patente de los Estados Unidos 5.858.708; Schwab, (1996) Neurochem. Res. 21, 755-761). Se han descrito también varios componentes de la materia blanca del SNC, NI35, NI250 (Nogo) y glicoproteína asociada a mielina (MAG), que tienen actividad inhibidora de la extensión axonal (Schwab y col., (1990) documento WO9005191; Schwab y col., (1997) Patente de los Estados Unidos 5.684.133). En particular, Nogo es un inhibidor del crecimiento axonal asociado a mielina, de 250 kDa, que se ha clonado y caracterizado (Nagase y col., (1998) DNA Res. 5, 355-364; Schwab, (1990) Exp. Neurol. 109,2-5). Se identificó el ADNc de Nogo en primer lugar mediante el análisis aleatorio del ADNc de cerebro y no se sugirió la función (Nagase y col., (1998) DNA Res. 5, 355-364).

Schwab y colaboradores publicaron la secuencia de seis péptidos derivados aleatoriamente procedentes de una digestión proteolítica de la presunta proteína NI250 (Nogo) de bovino (Spillmann y col., (1998) J. Biol. Chem. 273, 19283-19293).Recientemente, se depositó una probable secuencia del ADNc de longitud completa de esta proteína en el GenBank. Este clon de ADNc humano de 4,1 kilobases, KIAA0886 se derivó del esfuerzo del Kazusa DNA Research Institute para secuenciar ADNc aleatorio de elevado peso molecular procedente de cerebro (Nagase y col., (1998) DNA Res. 31, 355-364). Este novedoso clon de ADNc codifica una proteína de 135 kDa que incluye las seis secuencias peptídicas derivadas de Nogo de bovino.

La secuencia Nogo-A humana comparte una elevada homología en su tercer carboxilo con la familia de la proteína Reticulon (Rtn). Rtn1 también ha sido de nominada como proteína específica neuroendocrina (NSP) debido a que se expresa exclusivamente en células neuroendocrinas (Van de Velde y col., (1994) J. Cell. Sci. 107, 2403-2416). Todas las proteínas Rtn comparten una región con un resto de 200 aminoácidos de similitud de la secuencia en el término carboxilo de la proteína (Van de Velde y col., (1994) J. Cell. Sci. 107, 2403-2416; Roebroek y col., (1996) Genomics 32, 191-199; Roebroek y col., (1998) Genomics 51, 98-106; Moreira y col., (1999) Genomics 58, 73-81; Morris y col., (1991) Biochim. Biophys. Acta 1450, 68-76). Se han reconocido secuencias relacionadas en los genomas de la mosca y el gusano (Moreira y col., (1999) Genomics 58, 73-81). Esta región es aproximadamente un 70% idéntica a lo largo de la familia Rtn. Las regiones aminoterminales no están relacionadas entre sí y se derivan de diversos episodios alternativos de corte y empalme del ARN.

Del análisis de las secuencias depositadas en el GenBank y por la homología con las isoformas publicadas de Rtn1, se predicen tres formas de la proteína Nogo (Nogo-A, Nogo-B, Nogo-C). Nogo-B, de 37 kDa, puede corresponder posiblemente a NI35, y explica la actividad de inhibición de la extensión axonal de Ni35 y NI250 (Nogo-A) relacionada con la antigenicidad. Nogo-C-Myc presenta una movilidad electroforética de 25 kDa mediante SDS-PAGE y se ha descrito anteriormente como Rtn4...

1. Una molécula de ácido nucleico aislado seleccionada entre el grupo constituido por:

(a) una molécula de ácido nucleico aislado que codifica un fragmento de la SEC DE ID Nº: 2;

(b) una molécula de ácido nucleico aislado que se hibrida con una molécula de ácido nucleico que comprende el complemento de la SEC DE ID Nº: 1 en condiciones de elevada restricción; y

(c) una molécula de ácido nucleico aislado con al menos un setenta y cinco por ciento de homología de la secuencia con la SEC DE ID Nº: 1;

en la que dicha molécula de ácido nucleico aislado codifica un polipéptido que bloquea la inhibición del crecimiento axonal que está mediada por el receptor NOGO de la SEC DE ID Nº: 2.

2. La molécula de ácido nucleico aislado de la Reivindicación 1 en la que dicha molécula de ácido nucleico se une de manera operable con uno o más elementos de control de la expresión.

3. Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico aislado de la Reivindicación 1 o la Reivindicación 2.

4. Una célula huésped transformada para contener la molécula de ácido nucleico aislado de la Reivindicación 1 o la Reivindicación 2, o una célula huésped que contiene el vector de la Reivindicación 3.

5. La célula huésped de la Reivindicación 4, en la que dicha célula huésped es una célula eucariota.

6. Un procedimiento para producir un polipéptido que comprende la etapa de cultivar la célula huésped de la Reivindicación 4 o la Reivindicación 5 en condiciones en las que se exprese el polipéptido codificado por dicha molécula de ácido nucleico.

7. Un polipéptido aislado producido mediante el procedimiento de la Reivindicación 6.

8. Un polipéptido aislado seleccionado entre el grupo constituido por:

(a) un polipéptido aislado que comprende un fragmento de al menos 30 aminoácidos de la SEC DE ID Nº: 2; y

(b) un polipéptido aislado con al menos un setenta y cinco por ciento de homología en la secuencia de aminoácidos con la SEC DE ID Nº: 2;

en la que dicho polipéptido bloquea la inhibición del crecimiento axonal que está mediada por el receptor NOGO de la SEC DE ID Nº: 2.

9. El polipéptido aislado de la Reivindicación 8, en el que dicho polipéptido es un polipéptido aislado con al menos un ochenta por ciento de identidad en la secuencia de aminoácidos con la SEC DE ID Nº: 2.

10. El polipéptido aislado de la Reivindicación 8, en el que dicho polipéptido es un polipéptido aislado con al menos un noventa por ciento de identidad en la secuencia de aminoácidos con la SEC DE ID Nº: 2.

11. El polipéptido aislado de la Reivindicación 8, en el que dicho polipéptido es un polipéptido aislado con al menos un noventa y cinco por ciento de identidad en la secuencia de aminoácidos con la SEC DE ID Nº: 2.

12. Un polipéptido quimérico que comprende el polipéptido de una cualquiera de las Reivindicaciones 7 a 11, en el que dicho polipéptido bloquea la inhibición del crecimiento axonal que está mediada por el receptor NOGO de la SEC DE ID Nº: 2.

13. Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a un polipéptido de una cualquiera de las Reivindicaciones 7 a 11 en el que dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno inhibe la unión entre el receptor NOGO de la SEC DE ID Nº: 2 y el polipéptido NOGO de la SEC DE ID Nº: 6 y en el que dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno bloquea la inhibición del crecimiento axonal que está mediada por el receptor NOGO de la SEC DE ID Nº: 2.

14. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la Reivindicación 13, en el que dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno es un anticuerpo monoclonal.

15. Una composición que comprende el polipéptido de una cualquiera de las Reivindicaciones 7 a 12, o un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la Reivindicación 13 o la Reivindicación 14, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

16. La composición de la Reivindicación 15, en la que la composición se formula para administración parenteral, subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, transdérmica, bucal u oral, o para administración mediante microinfusión.

17. Uso del polipéptido de una cualquiera de las Reivindicaciones 7 a 12, o del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la Reivindicación 13 o de la Reivindicación 14, para la preparación de un medicamento para estimular el crecimiento axonal.

18. Uso del polipéptido de una cualquiera de la Reivindicaciones 7 a 12, o del anticuerpo o del fragmento de unión a antígeno de la Reivindicación 13 o de la Reivindicación 14, para la preparación de un medicamento para estimular la regeneración axonal.

19. Uso de la molécula de ácido nucleico de la Reivindicación 1 o de la Reivindicación 2, el polipéptido de una cualquiera de las Reivindicaciones 7 a 12, o del anticuerpo o del fragmento de unión a antígeno de la Reivindicación 13 o de la Reivindicación 14, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad, trastorno, o lesión del sistema nervioso central (SNC), en un mamífero.

20. El uso de la Reivindicación 19, en el que dicha enfermedad, trastorno, o lesión del SNC se selecciona entre el grupo constituido por trauma craneal o cerebral, lesión de la médula espinal, apoplejía o enfermedad desmielinante.

21. El uso de la Reivindicación 20, en el que dicha enfermedad desmielinante se selecciona entre el grupo constituido por esclerosis múltiple, desmielinación monofásica, encefalomielitis, leucoencefalopatía multifocal, panencefalitis, enfermedad de Marchiafava-Bignami, mielinolisis pontina, adrenoleucodistrofia, enfermedad de Pelizaeus-Merzbacher, degeneración espongiforme, enfermedad de Alexander, enfermedad de Canavan, leucodistrofia metacromática, y enfermedad de Krabbe.

22. Un procedimiento in vitro para estimular el crecimiento axonal que comprende poner en contacto una neurona con el polipéptido de una cualquiera de las Reivindicaciones 7 a 12 o el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno de la Reivindicación 13 o de la Reivindicación 14.

23. Un procedimiento in vitro para estimular la regeneración axonal que comprende poner en contacto una neurona con el polipéptido de una cualquiera de las Reivindicaciones 7 a 12 o el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno de la Reivindicación 13 o de la Reivindicación 14.