BIOSENSORES ELECTROQUIMICOS.

Un biosensor electroquímico para determinar la concentración de un analito en una muestra que consta de:

un sustrato base (400) y un sustrato de cubierta (300);

un espaciador para la introducción de la muestra (200) que tiene una parte de introducción de muestras (100), dicho espaciador que introduce la muestra está posicionado entre el sustrato base y el sustrato de cubierta; y,

por lo menos un electrodo de trabajo (104) impreso sobre el sustrato base (400) y por lo menos un electrodo de referencia (105) impreso por lo menos sobre un sustrato base y la superficie interior del sustrato de cubierta y una oxidasa y un mediador de transferencia electrónica aportado sobre el sustrato base, caracterizado porque la parte de introducción de muestras (100) está formada en un extremo del espaciador que introduce la muestra (200), la parte de introducción de muestras consta de:

un pasaje de introducción de muestras (101), un pasaje de descarga de aire (102) y un hueco (103), dicho pasaje de introducción de muestras (101) y el pasaje de descarga de aire (102) están conectados formando un ángulo de 45-135º, con preferencia un ángulo de 75-105º, en el extremo del pasaje de introducción de muestras, y el hueco (103) es un espacio adicional formado en el extremo del pasaje de introducción de muestras en dirección opuesta al flujo de entrada de la muestra y la proporción entre la anchura del pasaje de descarga de aire (103) y la del pasaje de introducción de muestras (101) no es superior a 1:2

Biosensores electroquímicos.

Ámbito de la invención

La presente invención se refiere a biosensores electroquímicos. Más en particular, la presente invención se refiere a biosensores electroquímicos que tienen una parte ampliada de introducción de muestras; la parte de introducción de muestras consta de un pasaje de introducción de muestras, un pasaje de descarga de aire y un hueco; el pasaje de introducción de muestras se comunica con el pasaje de descarga de aire y el hueco está formado en el punto de comunicación. La presente invención proporciona además un método para determinar la fluidez de muestras de sangre utilizando dicha parte de introducción de muestras.

Antecedentes de la invención

El seguimiento periódico de los niveles de glucosa en la sangre es necesario para el diagnóstico y la profilaxis de la diabetes mellitus. Los analizadores convencionales para detectar el nivel de glucosa en la sangre son analizadores de tipo cinta, basados en métodos colorimétricos o electroquímicos.

El método colorimétrico depende de la reacción colorimétrica de la oxidasa de la glucosa.

El método colorimétrico se basa en la reacción colorimétrica de la oxidasa de la glucosa:

glucosa + O₂ rightarrow ácido glucónico + H₂O₂ (catalizador: oxidasa de la glucosa)

H₂O₂ + colorante rightarrow producto (catalizador: peroxidasa)

Tal como se muestra en la reacción, la glucosa reacciona con el oxígeno y se oxida a ácido glucónico y peróxido de hidrógeno en presencia de la oxidasa de la glucosa. Con la peroxidasa, el peróxido de hidrógeno se reduce después a agua, oxidando al mismo tiempo a un receptor cromóforo de oxígeno. Esta reacción produce un cambio de color proporcional al nivel de la glucosa en la sangre.

Sin embargo, este método colorimétrico requiere una actuación precisa, porque el cambio de color (o la intensidad) depende del grado de transporte y tratamiento previo de la muestra, de la cantidad de muestra, del tiempo de reacción y del tiempo de coloración. Además, la coagulación de la sangre o la presencia de materiales interferentes (por ejemplo, ácido úrico, ácido ascórbico y bilirrubina) pueden falsear el análisis colorimétrico.

El método electroquímico puede soslayar los problemas anteriores, proporcionando una selectividad y sensibilidad elevadas. Por ejemplo, un biosensor electroquímico permite introducir las muestras sin tratamiento previo, incluso cuando las muestras son turbias y permite analizar cuidadosamente el nivel de glucosa en un período corto de tiempo.

Tanto el método colorimétrico como el electroquímico, que utilizan oxígeno como mediador de la transferencia electrónica, se denominan biosensores de la primera generación. El método electroquímico de segunda generación adopta compuestos organometálicos (que contienen derivados p.ej. de Fe, Os, Ru), quinonas, derivados de quinona, sales orgánicas conductoras o viológeno como mediador de la transferencia electrónica. Los sensores electroquímicos de segunda generación se basan en la siguiente reacción:

glucosa + GOx_-FAD rightarrow ácido glucónico + GOx_-FADH2

GOx_-FADH2 + M_ox rightarrow GOx_-FAD + M_red

(en la que, GOx significa la oxidasa de la glucosa; GOx_-FAD y GOx_-FADH2 significan un estado oxidado y un estado reducido de la oxidasa de la glucosa, respectivamente; y M_ox y M_red significan el medio de la transferencia electrónica oxidado y reducido, respectivamente).

Tal como se indica en la reacción, la glucosa se oxida a ácido glucónico reduciendo la GOx_-FAD a GOx_-FADH2. La oxidasa de la glucosa reducida transfiere un electrón o electrones al mediador de la transferencia electrónica M_ox y después vuelve a su estado inicial. Durante esta reacción se mide en la superficie del electrodo la corriente redox así generada.

La cinta del biosensor electroquímico consta de: a) por lo menos un sustrato, sobre el que se ha impreso un sistema de electrodo (un electrodo de trabajo, un electrodo auxiliar y/o un electrodo de referencia); b) una oxidasa y un mediador de transferencia electrónica inmovilizado sobre el sistema de electrodo y c) una parte de introducción de muestras. La cinta del biosensor electroquímico puede clasificarse en cuatro tipos: (1) un biosensor de tipo plano sobre cuyo sustrato base se imprimen un electrodo de trabajo y un electrodo auxiliar (o electrodo de referencia); (2) un biosensor de tipo opuesto, en el que el electrodo de trabajo y el electrodo auxiliar están enfrentados; (3) un biosensor diferencial de tipo plano; y (4) un biosensor diferencial de tipo opuesto.

La mayor parte de biosensores comerciales tienen una parte de introducción de muestras que puede clasificarse como de tipo i o como de tipo de línea horizontal.

La parte de introducción de muestras de tipo i consta de un sustrato base, un espaciador de película fina (por ejemplo, 100-500 µm) con una porción de corte (cut-out) en forma de U y una placa de cubierta con un orificio de ventilación para la descarga de aire. El orificio de ventilación puede estar también dispuesto en la placa base. Este tipo de biosensor proporciona una introducción rápida de la muestra líquida a través del capilar de tipo i, que adolece del inconveniente de que la cantidad de muestra introducida no se controla con precisión, porque el canal en forma de U se halla a menudo demasiado lleno o poco lleno alrededor del orificio de ventilación; el llenado del canal de muestras depende de forma significativa de la fluidez de sangre, que varían en gran manera según el nivel de hematocrito. Otro inconveniente del tipo i es que el manejo inadecuado de la cinta contamina fácilmente al usuario con la sangre despedida por el orificio de ventilación.

La parte de introducción de muestras de tipo línea horizontal está formada por el espaciador dispuesto en forma de canal estrecho de flujo que cruza la cinta entre los sustratos de base y de cubierta; se introduce la muestra por la entrada existente en una cara lateral, mientras que el aire del espacio se descarga a través de una salida existente en otra cara lateral. Este tipo de biosensor adolece también del inconveniente de que la muestra debe introducirse lateralmente, obligando a menudo al usuario a colocar la cinta en una posición incómoda sobre la zona de muestreo.

En US-6,299,757, de Feldman y col., se describe un sensor que incluye un espaciador y un canal de muestras. Aunque se describen algunas formas de ejecución, en las que existe una zona ampliada en el espaciador, la función de la zona está limitada a obtener cámaras grandes de muestras.

Por lo tanto, según el primer aspecto de la presente invención, se proporciona un biosensor electroquímico equipado con una parte de introducción de muestras que permite una introducción rápida de una muestra de sangre en la punta de la cinta, en una cantidad precisa, para la determinación electroquímica.

La sangre humana contiene partículas sólidas (hematocritos), por ejemplo eritrocitos, leucocitos y otras proteínas, que pueden separarse del plasma. Estas partículas cambian la fluidez y la conductividad eléctrica de la sangre. Hay que advertir que la muestra se introduce con diferente velocidad en el canal capilar de la cinta del biosensor y que el tiempo de llenado de la muestra es una función del nivel de hematocrito.

Por consiguiente, según el segundo aspecto de la presente invención, se proporciona un biosensor electroquímico equipado con un electrodo para determinar la fluidez, que mide el tiempo de llenado de la muestra en el capilar y un método para corregir los valores con respecto a los obtenidos con un nivel determinado de hematocrito.

Resumen de la invención

Un objeto de la presente invención consiste en proporcionar un biosensor electroquímico con una parte de introducción de muestras que permite la introducción rápida y precisa de muestras fisiológicas, sin ningún tratamiento previo de las muestras de sangre.

Otro objeto de la presente invención consiste en proporcionar un biosensor electroquímico equipado con un electrodo que determina la fluidez de la muestra,...

1. Un biosensor electroquímico para determinar la concentración de un analito en una muestra que consta de:

un sustrato base (400) y un sustrato de cubierta (300);

un espaciador para la introducción de la muestra (200) que tiene una parte de introducción de muestras (100), dicho espaciador que introduce la muestra está posicionado entre el sustrato base y el sustrato de cubierta; y,

por lo menos un electrodo de trabajo (104) impreso sobre el sustrato base (400) y por lo menos un electrodo de referencia (105) impreso por lo menos sobre un sustrato base y la superficie interior del sustrato de cubierta y una oxidasa y un mediador de transferencia electrónica aportado sobre el sustrato base, caracterizado porque la parte de introducción de muestras (100) está formada en un extremo del espaciador que introduce la muestra (200), la parte de introducción de muestras consta de:

un pasaje de introducción de muestras (101), un pasaje de descarga de aire (102) y un hueco (103), dicho pasaje de introducción de muestras (101) y el pasaje de descarga de aire (102) están conectados formando un ángulo de 45-135º, con preferencia un ángulo de 75-105º, en el extremo del pasaje de introducción de muestras, y el hueco (103) es un espacio adicional formado en el extremo del pasaje de introducción de muestras en dirección opuesta al flujo de entrada de la muestra y la proporción entre la anchura del pasaje de descarga de aire (103) y la del pasaje de introducción de muestras (101) no es superior a 1:2.

2. El biosensor electroquímico según la reivindicación 1, que consta de un electrodo de trabajo (104) y un electrodo de referencia (105) impresos sobre la superficie superior del sustrato base (400).

3. El biosensor electroquímico según la reivindicación 1, que comprende además un electrodo conector (106) impreso sobre la superficie superior del sustrato base (400') y sobre la superficie interior del sustrato de cubierta (300'), que consta de un electrodo de trabajo (104') impreso sobre la superficie superior del sustrato base (400') y un electrodo de referencia (105') impreso sobre la superficie interior del sustrato de cubierta (300').

4. El biosensor electroquímico según la reivindicación 2, que comprende además:

un segundo espaciador para la introducción de la muestra (200b) con la parte de introducción de muestras (100) descrita en la reivindicación 1 y unida a la superficie inferior del sustrato base (400a);

un segundo sustrato de cubierta (300b), prensado sobre la superficie exterior del segundo espaciador de introducción de muestra (200b);

un segundo electrodo de trabajo (104) y un segundo electrodo de referencia (105) impresos sobre la superficie inferior del sustrato base (400a); y

BSA y un segundo mediador de transferencia electrónica aportado sobre la superficie inferior del sustrato base (400a).

5. El biosensor electroquímico según la reivindicación 3, que comprende además:

un segundo espaciador para la introducción de muestra (200b') con la parte de introducción de muestras (100) descrita en la reivindicación 1 y unido a la superficie inferior del sustrato base (400b);

un segundo sustrato de cubierta (300b'), prensado sobre la superficie exterior del segundo espaciador de introducción de muestra (200b');

un segundo electrodo de trabajo (104') impreso sobre la superficie inferior del sustrato base (400b);

BSA y un segundo mediador de transferencia electrónica aportado sobre la superficie inferior del sustrato base (400b);

un segundo electrodo de referencia (105') impreso sobre la superficie interior del segundo sustrato de cubierta (300b'); y

un segundo electrodo conector (106) impreso sobre la superficie inferior del sustrato base (400b) y sobre la superficie interior del segundo sustrato de cubierta (300b').

6. El biosensor electroquímico según la reivindicación 3 que consta además de un electrodo para determinar la fluidez (107) impreso sobre la superficie superior del sustrato base (400').

7. El biosensor electroquímico según una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 6, en el que la proporción entre la anchura del pasaje de descarga de aire y la del pasaje de introducción de muestras se sitúa entre 1:5 y 1:2.

8. El biosensor electroquímico según una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 7, en el que la parte de introducción de muestras tiene capacidad para introducir de 0,1 a 3,0 µl de muestra.

9. El biosensor electroquímico según una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 7, en el que la parte de introducción de muestras (100) tiene capacidad para introducir de 0,1 a 1,0 µl de muestra.

10. El biosensor electroquímico según una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 7, en el que la parte de introducción de muestras tiene capacidad para introducir de 0,3 a 0,7 µl de muestra.

11. El biosensor electroquímico según una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 10, en el que el pasaje de introducción de muestras está conectado al pasaje de descarga de aire de manera aproximadamente perpendicular, con preferencia en un ángulo de 90º.

12. El biosensor electroquímico según una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 11, en el que la oxidasa se elige entre el grupo formado por la oxidasa de la glucosa, la lactato-oxidasa, la colesterol-oxidasa, la glutamato-oxidasa, la peroxidasa de rábano rusticano y la oxidasa de alcohol.

13. El biosensor electroquímico según una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 12, en el que el mediador de transferencia electrónica se elige entre el grupo formado por el cloruro de hexaaminorrutenio (III), ferricianuro potásico, ferrocianuro potásico, dimetilferroceno, ferricinio, ácido ferrocenomonocarboxílico, 7,7,8,8-tetracianoquinodimetano, tetratiafulvaleno, niqueloceno, N-metilacidinio, tetratiatetraceno, N-metilfenazinio, hidroquinona, ácido 3-dimetilaminobenzoico, 3-metil-2-benzotiozolinona-hidrazona, 2-metoxi-4-alilfenol, 4-aminoantipirina, dimetilanilina, 4-aminoantipireno, 4-metoxinaftol, 3,3',5,5'-tetrametilbencidina, sulfonato de 2,2-azino-di-[3-etilbenzotiazolina], o-dianisidina, o-toluidina, 2,4-dicloro-fenol, 4-aminofenazona, bencidina y azul Prusia.

14. El biosensor electroquímico según la reivindicación 13, en el que el mediador de transferencia electrónica es el cloruro de hexaaminorrutenio (III).