ANTICUERPOS CONTRA FORMAS CONFORMACIONALMENTE ANORMALES DE PROTEINA TAU PRESENTE EN TEJIDOS CON ENFERMEDAD DE ALZHEIMER.

Anticuerpo con una especificidad por las formas truncadas de la proteína tau humana,

que está truncada en el extremo N-terminal o bien tanto en el extremo N-terminal como en el extremo C-terminal, tal como se determina en ELISA, empleándose dichas formas truncadas de la proteína tau humana purificadas mediante electroforesis, en muestras de tejido de cerebro con enfermedad de Alzheimer fijadas con paraformaldehido tamponado al 4% a 4ºC utilizando inmunohistoquímica, o tal como se determina mediante transferencia Western, utilizando dichas formas truncadas de las proteínas tau humanas purificadas sobre geles de SDS-poliacrilamida y transferidas a membranas PVDF, siendo dichas formas truncadas diferentes conformacionalmente de la tau humana normal, dicha forma diferente conformacionalmente de la proteína tau es específicamente reconocible por un anticuerpo producido por la linea celular de hibridoma depositada DC-11 o DC-11/I con los números de depósito 00082215 y 00082216 de la ECACC y dichas formas truncadas comprenden, como mínimo, del residuo de aminoácido 300 al residuo 400 de la isoforma de tau humana más larga que comprende 441 aminoácidos, no uniéndose dicho anticuerpo a la proteína tau normal y siendo dicho anticuerpo especifico de dichas formas truncadas de la proteína tau humana

Anticuerpos contra formas conformacionalmente anormales de proteína tau presente en tejidos con enfermedad de alzheimer.

La presente invención se refiere a la enfermedad de Alzheimer y a otras tauopatías.

La enfermedad de Alzheimer (AD) es el trastorno neurodegenerativo crónico más común que se caracteriza clínicamente por una pérdida progresiva e irreversible de la función cognitiva y del comportamiento. La enfermedad puede persistir durante 10 años, progresando desde síntomas leves hasta manifestaciones extremadamente graves. La AD afecta aproximadamente al 10 de la población con edad por encima de los 65 años y al 20 de la población con edad por encima de los 80 años. Como resultado del crecimiento de las sociedades occidentales, el número de personas afectadas está aumentando: solamente en Estados Unidos ya existen cinco millones de afectados y a finales del año 2000, en el mundo habrán aproximadamente 18 millones de personas con demencia. De éstas, se cree que aproximadamente dos tercios de los casos, es decir, 12 millones, tendrán enfermedad de Alzheimer. Es la cuarta causa de muerte en el mundo occidental, por detrás de las enfermedades cardiacas, cáncer y derrame cerebral. El número de personas con demencia está aumentando rápidamente. En 2025, el número de personas con demencia será del doble en los paises desarrollados con respecto a 1980. El coste que supondrá a la sociedad el cuidado de estos enfermos es enorme. Por ejemplo, los costes para la sociedad de los Estados Unidos que implican el diagnóstico y tratamiento de la AD, principalmente para el cuidado y vigilancia, se estiman actualmente en 80 mil millones de dólares americanos anuales. Actualmente, no se dispone de ningún ensayo para el diagnóstico presintomático ni curación para la AD. Por lo tanto, la enfermedad se diagnostica clínicamente después de la aparición de los síntomas, principalmente por eliminación de otras formas de demencia. La acumulación de los indicadores clásicos, placas seniles (neuríticas) y ovillos neurofibrilares (NFT) en los cerebros con AD, observados hace 93 años por el psiquiatra bávaro Alois Alzheimer en 1907, siguen siendo la característica neuropatológica de la AD.

El denominador común de las estructuras neurofibrilares intracelulares (ovillos neurofibrilares, neuritas distróficas, e hilos del neurópilo) son filamentos helicoidales emparejados (PHF). La subunidad de proteína principal de los PHF es la proteína tau asociada a microtúbulos en una forma hiperfosforilada de forma anormal (Grundke-Iqbal y otros, 1986; Wischik y otros, 1988 a,b). Las neuronas con cambios neurofibrilares degeneran y en los individuos afectados el grado de esta degeneración se correlaciona directamente con el grado de demencia (Blessed y otros, 1968).

La tau normal es una proteína asociada a microtúbulos que se distribuye principalmente en los axones. La proteína tau forma parte de la modulación del ensamblaje, organización espacial y comportamiento de los microtúbulos (MT) en las neuronas y probablemente en los cuerpos de las células gliales (Drewes y otros, 1998; Drubin y Kirschner, 1986; Lo-Presti y otros, 1995). Las proteínas tau están codificadas por un único gen localizado en el cromosoma 17, pero se detectan como múltiples isoformas en extractos de tejido de cerebros adultos (Goedert y otros, 1989; Himmler A., 1989; Kosik y otros, 1989). La heterogeneidad de las proteínas tau es debida, en parte, al corte y empalme alternativo, que da lugar a seis isoformas en el cerebro humano adulto. Estas isoformas distintas se diferencian por la presencia o ausencia de inserciones de 29 ó 58 aminoácidos en la región amino terminal y por la adición o eliminación de una repetición en tándem (que se puede repetir 3 ó 4 veces) en una región carboxi terminal de tau, a la que se hace referencia como dominio de unión a microtúbulos. Esta región comprende repeticiones imperfectas de 31 ó 32 residuos de aminoácidos. En los humanos, la isoforma de tau más pequeña contiene 352 residuos de aminoácidos con tres repeticiones en tándem en el dominio de unión a MT y ninguna inserción en el extremo amino terminal, mientras que la isoforma más grande contiene 441 residuos con cuatro repeticiones y ambas inserciones en el extremo amino terminal. Para simplificar, todas las numeraciones de la presente solicitud de patente hacen referencia a la isoforma más larga de la proteína tau humana, htau40, que contiene todas las inserciones (longitud de 441 aminoácidos) según Goedert y otros (1989).

Se conocen muchas enfermedades neurológicas que tienen inclusiones celulares filamentosas que contienen la proteína tau asociada a microtúbulos, por ejemplo, enfermedad de Alzheimer (AD), parálisis supranuclear progresiva (PSP), degeneración corticobasal (CBD), enfermedad de Pick (PiD) y un grupo de trastornos relacionados denominados colectivamente como demencia frontotemporal con Parkinsonismo unido al cromosoma 17 (FTDP-17), esclerosis lateral amiotrópica (ALS), enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (CJD), demencia pugilistica (DP), enfermedad de Gerstmann-Straussler-Scheinker (GSSD), enfermedad de cuerpos de Lewy y enfermedad de Huntington (Dickinson y otros, 1998; DiFiglia y otros, 1997; Forno, 1986; Hirano y Zimmerman, 1962; Nishimura y otros, 1995; Prusiner 1996; Reed y otros, 1998; Roberts, 1998; Schmidt y otros, 1996; Shankar y otros, 1989; Spillantini y otros, 1998). Aunque la etiología, los síntomas clínicos, los descubrimientos patológicos y la composición bioquímica de las inclusiones en estas enfermedades son diferentes, existe una prueba emergente que sugiere que los mecanismos implicados en la agregación de las proteínas celulares normales para formar diversas inclusiones filamentosas son comparables. Se cree que la alteración inicial en la conformación de la proteína tau asociada a microtúbulos, que inicia la generación de núcleos o semillas para el ensamblaje de los filamentos, es un aspecto clave. Este proceso puede estar influenciado por la modificación postraduccional de las proteínas normales, mediante mutación o eliminación de ciertos genes y por factores que se unen a las proteínas normales y, por lo tanto, alteran su conformación. La proteína tau es muy hidrofílica. Se puede extraer fácilmente del tejido del cerebro o de células cultivadas. En comparación, la tau filamentosa extraída de tejidos de cerebros enfermos de Alzheimer es relativamente insoluble. Además de la forforilación, la tau insoluble y la tau normal soluble se diferencian en el grado de modificaciones postraduccionales, que incluyen la glicosilación, glicación, ubiquitinación y racemización (Kenessey y otros, 1995; Ko y otros, 1999; Mori y otros, 1987; Wang y otros, 1996; Yan y otros, 1994).

Se desconoce el mecanismo mediante el cual la proteína tau se modifica para participar en la formación de filamentos en la AD. Tau es una de las proteínas conocidas más solubles (Cleveland 1977 a, b; Lee y otros 1988) y, por lo tanto, su agregación en la AD es particularmente enigmática. La fosforilación de tau afecta al potencial de tau para formar agregados, produciendo efectos estimuladores o bien inhibidores, dependiendo supuestamente del lugar de la fosforilación (Crowther y otros, 1994; Schneider y otros, 1999). Muchos estudios in vitro demuestran que en presencia del agente reductor, ditiotreitol (DTT), ácidos grasos insaturados libres, ARN o glicosaminoglicanos, la tau normal se puede transformar en filamentos (Goedert y otros, 1996; Kampers y otros, 1996; Perez y otros, 1996; Wilson y Binder, 1997). Además, el proceso de formación de filamentos también se puede acelerar por la presencia de la tau reticulada generada mediante la oxidación en la Cys322 (Schweers y otros, 1995). Entre los parámetros que se han variado en los diferentes estudios del ensamblaje de los filamentos se han incluido la concentración de la proteína tau, el pH y la fuerza iónica de la incubación es varias veces superior a la que existe en el citoplasma bajo condiciones fisiológicas. El análisis de los filamentos tau formados in vitro mediante microscopía electrónica de barrido y transmisión (STEM) mostró que estos filamentos difieren de los filamentos helicoidales emparejados nativos (Ksiezak-Reding, 1998). En ausencia de glicanos o ARN, no se detectan filamentos similares a los PHF en muestras que contienen tau de tipo salvaje sin fosforilar o fosforilada; tau normal. Los estudios de tau reticulada químicamente, tratada con heparina, indican que el tratamiento con heparina induce un cambio conformacional en la proteína tau (Paudel y Li, 1999). Si se consideran todos los datos in vitro éstos sugieren (a) que el dominio de unión a microtúbulos es importante...

1. Anticuerpo con una especificidad por las formas truncadas de la proteína tau humana, que está truncada en el extremo N-terminal o bien tanto en el extremo N-terminal como en el extremo C-terminal, tal como se determina en ELISA, empleándose dichas formas truncadas de la proteína tau humana purificadas mediante electroforesis, en muestras de tejido de cerebro con enfermedad de Alzheimer fijadas con paraformaldehido tamponado al 4% a 4ºC utilizando inmunohistoquímica, o tal como se determina mediante transferencia Western, utilizando dichas formas truncadas de las proteínas tau humanas purificadas sobre geles de SDS-poliacrilamida y transferidas a membranas PVDF, siendo dichas formas truncadas diferentes conformacionalmente de la tau humana normal, dicha forma diferente conformacionalmente de la proteína tau es específicamente reconocible por un anticuerpo producido por la linea celular de hibridoma depositada DC-11 o DC-11/I con los números de depósito 00082215 y 00082216 de la ECACC y dichas formas truncadas comprenden, como mínimo, del residuo de aminoácido 300 al residuo 400 de la isoforma de tau humana más larga que comprende 441 aminoácidos, no uniéndose dicho anticuerpo a la proteína tau normal y siendo dicho anticuerpo especifico de dichas formas truncadas de la proteína tau humana.

2. Anticuerpo, según la reivindicación 1, caracterizado porque la especificidad del anticuerpo por la forma truncada de la proteína tau humana es independiente del nivel de fosforilación de la proteína tau humana.

3. Anticuerpo, según la reivindicación 1, que es producido por la línea celular de hibridoma depositada DC-11 o DC-11/I con los números de depósito 00082215 y 00082216 de la ECACC.

4. Linea celular de hibridoma que produce un anticuerpo, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

5. Kit para la detección o aislamiento de formas truncadas de la proteína tau humana que está truncada en el extremo N-terminal o bien tanto en el extremo N-terminal como en el extremo C-terminal, siendo dichas formas truncadas diferentes conformacionalmente de la tau humana normal, dicha forma diferente conformacionalmente de la proteína tau es específicamente reconocible por un anticuerpo producido por la línea celular de hibridoma depositada DC-11 o DC-11/I con los números de depósito 00082215 y 00082216 de la ECACC, en una muestra de tejido de cerebro o fluido corporal en el que el kit comprende un anticuerpo, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y un recipiente adecuado para proporcionar la muestra.

6. Kit, según la reivindicación 5, caracterizado porque contiene adicionalmente medios para la detección de un fenómeno de unión de dicho anticuerpo que se une a dichas formas truncadas de la proteína tau humana, preferentemente anticuerpos secundarios, especialmente anticuerpos secundarios que están marcados específicamente.

7. Kit, según la reivindicación 5 ó 6, caracterizado porque contiene adicionalmente medios para la cuantificación de dichas formas truncadas de la proteína tau humana, especialmente una preparación patrón de dichas formas truncadas de la proteína tau humana.

8. Método in vitro para la detección de formas truncadas de la proteína tau humana que están truncadas en el extremo N-terminal o bien tanto en el extremo N-terminal como en el extremo C-terminal, siendo dichas formas truncadas diferentes conformacionalmente de la tau humana normal, dicha forma diferente conformacionalmente de la proteína tau es específicamente reconocible por un anticuerpo producido por la linea celular de hibridoma depositada DC-11 o DC-11/I con los números de depósito 00082215 y 00082216 de la ECACC, en una muestra de tejido de cerebro o de un fluido corporal de un paciente que comprende la mezcla de dicha muestra con un anticuerpo, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, la detección de la presencia de un fenómeno de unión entre dicho anticuerpo y dicha forma truncada de la proteína tau humana y, opcionalmente, la medición de la cantidad de dicha forma truncada de la proteína tau humana que está unida a dicho anticuerpo.

9. Método, según la reivindicación 8, caracterizado porque las formas truncadas de la proteína tau humana son también distinguibles de la tau humana normal por su capacidad para actuar como centro de nucleación para la iniciación de la agregación de tau.

10. Método, según la reivindicación 8 ó 9, caracterizado porque las formas truncadas de la proteína tau humana son también distinguibles de la tau humana normal por su capacidad de desensamblaje de los microtúbulos de la tau humana normal.

11. Método, según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, caracterizado porque dichas formas truncadas comprenden, como mínimo, del residuo de aminoácido 300 al residuo de aminoácido 400 de la isoforma de tau más larga que comprende 441 aminoácidos.

12. Método, según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, caracterizado porque dichas formas de la proteína tau comprenden, como mínimo, de 100 aminoácidos hasta 400 aminoácidos de la secuencia de la proteína tau normal.

13. Utilización de un anticuerpo, según las reivindicaciones 1 a 3, para la precipitación de un fármaco para el tratamiento de pacientes con la enfermedad de Alzheimer.