ANTICUERPO MONOCLONAL HUMANO ESPECIFICO PARA LIPOPOLISACARIDOS (LPS) DE SEROTIPO IATS 06 PSEUDOMONAS AERUGINOSA.

Anticuerpo monoclonal humano específico para el lipopolisacárido (LPS) del serotipo IATS O6 de P.

aeruginosa que comprende una cadena ligera y una cadena pesada, en donde la región variable de la cadena ligera del anticuerpo comprende SEQ ID NO:1 en la región CDR1, SEQ ID NO:2 en la región CDR2 y SEQ ID NO:3 en la región CDR3, y en donde la región variable de la cadena pesada del anticuerpo comprende SEQ ID NO:4 en la región CDR1, SEQ ID NO:5 en la región CDR2 y SEQ ID NO:6 en la región CDR3, o un fragmento Fab o F(ab'')2 o una mezcla de los mismos; o un derivado del mismo capaz de unirse a dicho LPS, en donde el derivado es una muteína del anticuerpo monoclonal humano que lleva de una a cinco sustituciones conservadoras en cualquiera de las regiones CDR en la cadena pesada y/o ligera

Anticuerpo monoclonal humano específico para lipopolisacáridos (LPS) de serotipo IATS O6 de Pseudomonas aeruginosa.

La presente invención se refiere a un anticuerpo monoclonal humano específico para el serotipo IATS O6 de P. aeruginosa, un hibridoma que lo produce, ácidos nucleicos que lo codifican y células huésped transfectadas con los mismos. Además, la presente invención se refiere a métodos para producir dicho anticuerpo monoclonal. Además, la presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden al menos un anticuerpo o al menos un ácido nucleico que codifica dicho anticuerpo.

Las enfermedades infecciosas emergieron drásticamente durante las últimas décadas. Las enfermedades infecciosas, incluyendo las infecciones respiratorias, son una de las principales causas de enfermedad en el mundo. En 1998, las enfermedades infecciosas se cobraron 16 millones de vidas y se clasificaron como la segunda causa principal de muerte en el mundo. Uno de los mayores problemas son las infecciones intrahospitalarias o nosocomiales. Tales infecciones han aumentado desde 7,2/1000 días de paciente en 1975 hasta 9,8/1000 días de paciente en 1995, un aumento del 36%. Junto con S. aureus resistente a meticilina (SARM) y enterococos resistentes a vancomicina (ERV), P. aeruginosa es responsable de hasta el 34% de todas las infecciones intrahospitalarias. Las principales víctimas de las infecciones por P. aeruginosa son pacientes de fibrosis quística, victimas de quemaduras, pacientes entubados, pacientes en las unidades de cuidados intensivos, pacientes de cáncer y SIDA, así como pacientes inmunosuprimidos que se han sometido a trasplante de órganos.

Para la prevención de infecciones crónicas por P. aeruginosa en pacientes de fibrosis quística, se ha establecido una vacuna octavalente conjugada que consiste en los 8 serotipos de LPS más relevantes de P. aeruginosa acoplados a toxina A detoxificada de P. aeruginosa para la inmunización activa. Los estudios a largo plazo con esta vacuna han mostrado que la proporción de pacientes infectados de forma crónica cayó desde alrededor del 72% hasta el 32% a la edad de 18 años. Sin embargo, la vacunación activa solo es posible en pacientes inmunocompetentes, así como en situaciones previsibles. De esta manera, la mayoría de las víctimas de P. aeruginosa no se pueden inmunizar activamente con la vacuna octavalente. Debido a esto y debido al hecho de que la mayoría de las cepas de P. aeruginosa son multirresistentes, existe una necesidad de una herramienta terapéutica alternativa para tratar a los pacientes infectados con P. aeruginosa. Un intento es crear anticuerpos monoclonales humanos basados en la tecnología de hibridomas o usando clonación de repertorio por presentación en fagos.

Ambos métodos y los anticuerpos creados mediante los mismos muestran serios inconvenientes.

La tecnología del hibridoma se basa en la inducción de células B murinas de la especificidad deseada mediante inmunización con un antígeno de elección e inmortalización mediante fusión con un compañero de mieloma, que es el planteamiento clásico de "Kohler y Milstein". Después de ello, la información genética de un clon productor de anticuerpo se puede volver a clonar y humanizar, bien mediante injerto de CDR o mediante la tecnología de presentación en fago.

Se sabe que los anticuerpos monoclonales murinos dirigidos contra LPS bacteriano reconocen epítopos diferentes que los anticuerpo humanos. Por lo tanto, la generación de anticuerpos monoclonales en ratones seguida por humanización no produciría necesariamente el aislamiento de anticuerpos con la especificidad de interés para su uso en seres humanos. Ha habido diferentes intentos de generar anticuerpos monoclonales humanos contra grupos de LPS de P. aeruginosa. Sin embargo, muchos de ellos carecen de funciones efectoras y por lo tanto no eran protectores.

US-4834975 por Siadak et al., divulga un anticuerpo monoclonal humano C5B7 que es específico para LPS del inmunotipo 1 de Fisher de P. aeruginosa (correspondiente a IATS O6). Dicho anticuerpo tiene propiedades opsonofagocíticas y protege ratones in vivo a una dosis de 50 µg.

Según esto, un problema técnico subyacente a la presente invención es proporcionar un anticuerpo monoclonal humano específico para LPS de un serotipo particular de P. aeruginosa en donde el anticuerpo muestra gran capacidad de protección, en particular in vivo.

El problema técnico se resuelve mediante los anticuerpos monoclonales humanos como se definen a continuación.

Según la presente invención, se proporciona un anticuerpo monoclonal humano específico para LPS del serotipo IATS O6 de P. aeruginosa en donde la región variable de la cadena ligera del anticuerpo comprende SEQ ID NO:1 en la región CDR1, SEQ ID NO:2 en la región CDR2 y SEQ ID NO:3 en la región CDR3, y en donde la región variable de la cadena pesada del anticuerpo comprende SEQ ID NO:4 en la región CDR1, SEQ ID NO:5 en la región CDR2 y SEQ ID NO:6 en la región CDR3; o un fragmento o derivado del mismo capaz de unirse a dicho LPS.

La presente invención proporciona además un hibridoma capaz de producir el anticuerpo monoclonal y los ácidos nucleicos que codifican la cadena ligera y pesada del anticuerpo, respectivamente. Además, la presente invención proporciona vectores y células huésped, que comprenden el ácido nucleico. Además, se proporcionan métodos para producir los anticuerpos monoclonales. Además, se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden al menos un anticuerpo y/o al menos un ácido nucleico, y segundos usos médicos de las mismas.

Sorprendentemente, se ha determinado que los anticuerpos monoclonales humanos según la invención muestran gran capacidad de protección. En particular, se demostró que el anticuerpo monoclonal humano era opsonofagocítico in vitro. Incluso más importante, los anticuerpos monoclonales según la presente invención muestran capacidad de protección in vivo determinada por la protección a septicemia en el modelo murino de heridas por quemadura como se muestra en los ejemplos.

Según la presente invención el anticuerpo es específico para el LPS del serotipo IATS O6 de P. aeruginosa y muestra un valor de opsonofagocitosis determinado usando bacterias conjugadas a fluorescencia de menos de 0,01 µg/ml. No se ha descrito ningún anticuerpo en la técnica anterior que muestre actividad opsonofagocítica.

Al contrario que los anticuerpos del estado de la técnica, el anticuerpo monoclonal según la presente invención reconoce aislados clínicos con gran especificidad. Se identificaron 38 de 38 muestras de pacientes infectados con P. aeruginosa del serotipo IATS O6 usando este anticuerpo. Sin estar vinculados a ninguna teoría, se asume que el anticuerpo monoclonal es capaz de reconocer cada uno de los subtipos de IATS O6 conocidos en técnica anterior. Esta propiedad hace el anticuerpo particularmente útil para el diagnóstico y la terapia. De esta manera, el anticuerpo según la presente invención muestra una fiabilidad insuperable.

El término "anticuerpo monoclonal humano" como se usa aquí abarca cualquier anticuerpo monoclonal humano parcial o total independientemente de la fuente de la que obtiene el anticuerpo monoclonal. Se prefiere la producción del anticuerpo monoclonal humano por un hibridoma. También se puede obtener el anticuerpo monoclonal mediante ingeniería genética y en particular injerto de CDR de los segmentos CDR como se define en las reivindicaciones en anticuerpos monoclonales disponibles cambiando las regiones CDR del anticuerpo base con los segmentos CDR específicos como se define en las reivindicaciones.

El término "región CDR" significa la región determinante de complementariedad de un anticuerpo, es decir, la región que determina la especificidad de un anticuerpo por un antígeno particular. Tres regiones CDR (CDR1 a CDR3) son responsables de la unión al antígeno en la cadena pesada.

Las posiciones de las regiones CDR en la cadena pesada son como sigue:

Región CDR1, aminoácidos 31 a 35 en el exón V_H

Región CDR2, aminoácidos 50 a 65 en el exón V_H

Región CDR3, aminoácidos 95 y siguientes en el exón V_H

Las posiciones de las regiones CDR son independientes de la clase de anticuerpo, es decir, IgM, IgA o IgG.

Las posiciones de las...

1. Anticuerpo monoclonal humano específico para el lipopolisacárido (LPS) del serotipo IATS O6 de P. aeruginosa que comprende una cadena ligera y una cadena pesada, en donde la región variable de la cadena ligera del anticuerpo comprende SEQ ID NO:1 en la región CDR1, SEQ ID NO:2 en la región CDR2 y SEQ ID NO:3 en la región CDR3, y en donde la región variable de la cadena pesada del anticuerpo comprende SEQ ID NO:4 en la región CDR1, SEQ ID NO:5 en la región CDR2 y SEQ ID NO:6 en la región CDR3, o un fragmento Fab o F(ab')₂ o una mezcla de los mismos; o un derivado del mismo capaz de unirse a dicho LPS, en donde el derivado es una muteína del anticuerpo monoclonal humano que lleva de una a cinco sustituciones conservadoras en cualquiera de las regiones CDR en la cadena pesada y/o ligera.

2. Anticuerpo monoclonal humano específico para LPS del serotipo IATS O6 de P. aeruginosa en donde la región variable de la cadena ligera del anticuerpo tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:7 y la región variable de la cadena pesada tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:8; o una variante de dicho anticuerpo capaz de unirse a dicho LPS en donde la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo es al menos el 95% homóloga a SEQ ID NO:7 y la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo es al menos el 95% homóloga a SEQ ID NO:8.

3. Anticuerpo monoclonal humano de cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2 en donde la cadena ligera es de tipo kappa.

4. Anticuerpo monoclonal humano de cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2 en donde la cadena ligera es de tipo lambda.

5. Anticuerpo monoclonal humano de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en donde la cadena pesada es del tipo IgM, IgA o IgG.

6. Anticuerpo monoclonal humano de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en donde el anticuerpo consiste completamente en secuencia humana de aminoácidos.

7. Anticuerpo monoclonal humano de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en donde el anticuerpo muestra reconocimiento antigénico humano.

8. Anticuerpo monoclonal humano de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 en donde el anticuerpo está modificado en el N-terminal, internamente y/o en el C-terminal.

9. Anticuerpo monoclonal humano de la reivindicación 8 en donde la modificación se selecciona de al menos una de oligomerización y conjugación a un fármaco y/o un marcador.

10. Anticuerpo monoclonal humano de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 obtenible de una célula B humana o un hibridoma obtenido mediante fusión de dicha célula B humana con una célula de mieloma o heteromieloma.

11. Hibridoma capaz de producir el anticuerpo monoclonal humano de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 ó 10.

12. Ácido nucleico que codifica la cadena ligera del anticuerpo monoclonal humano de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 ó 10.

13. Ácido nucleico que codifica la cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 ó 10.

14. Vector que comprende al menos un ácido nucleico que codifica la cadena ligera de la reivindicación 12 y/o al menos un ácido nucleico que codifica la cadena pesada de la reivindicación 13.

15. Vector según la reivindicación 14, en donde el vector también comprende un promotor unido operativamente al ácido nucleico para facilitar la expresión del mismo.

16. Célula huésped que comprende el vector de la reivindicación 14 y/o el ácido nucleico de la reivindicación 12 ó 13.

17. Un método para producir el anticuerpo monoclonal humano de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 ó 10 que comprende los pasos de cultivar el hibridoma de la reivindicación 11 en condiciones que permitan la secreción de un anticuerpo, y para cultivar la célula huésped de la reivindicación 16 en condiciones adecuadas para la expresión del anticuerpo monoclonal humano.

18. Composición farmacéutica que comprende al menos un anticuerpo monoclonal humano de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 y/o al menos un ácido nucleico de la reivindicación 12 ó 13.

19. Uso del anticuerpo monoclonal humano de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 y/o del ácido nucleico de la reivindicación 12 ó 13 para la preparación de un medicamento para la profilaxis y/o tratamiento de una infección por P. aeruginosa en un paciente humano.

20. Uso según la reivindicación 19 en donde la infección por P. aeruginosa es una infección intrahospitalaria.

21. Kit de prueba para el diagnóstico de una infección por P. aeruginosa en una muestra que comprende al menos un anticuerpo monoclonal humano de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 y/o al menos un ácido nucleico de la reivindicación 12 ó 13.