PROCEDIMIENTO PARA AISLAR GENES IMPLICADOS EN LA BIOSINTESIS DE ESTREPTOLIDIGINA, MOLECULAS DE ADN, MANIPULACION GENETICA DE LA RUTA Y SUS USOS.
Procedimiento para aislar genes implicados en la biosíntesis de estreptolidigina,
moléculas de ADN, manipulación genética de la ruta y sus usos. La invención proporciona un procedimiento de aislamiento y purificación de un fragmento de ácido nucleico que contiene la agrupación de genes de la ruta de biosíntesis de estreptolidigina. También proporciona moléculas de ácido nucleico, moléculas de ácido nucleico recombinante, polipéptidos codificados por estas moléculas, células hospedadoras que contienen estas moléculas y sus usos. También proporciona un proceso para incrementar la producción de metabolitos tetrámicos en un hospedador bacteriano, un proceso para generar derivados de estreptolidigina o precursores de estreptolidigina y sus usos. También es objeto de la invención una cepa recombinante de Streptomyces lydicus y los derivados de estreptolidigina producidos por ella. De aplicación en la obtención de cepas superproductoras de estreptolidigina o derivados de estreptolidiginapara su aislamiento y utilización, entre otros, en el sector farmaceútico o químico
Tipo: Patente de Invención. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: P200901727.
Solicitante: UNIVERSIDAD DE OVIEDO.
Nacionalidad solicitante: España.
Provincia: ASTURIAS.
Inventor/es: OLANO ALVAREZ,CARLOS, FERNANDEZ BRAA,ALFREDO, SALAS FERNANDEZ,JOSE ANTONIO, GOMEZ SUAREZ,CRISTINA, MENDEZ FERNANDEZ,M. DEL CARMEN.
Fecha de Solicitud: 30 de Julio de 2009.
Fecha de Publicación: .
Fecha de Concesión: 14 de Octubre de 2010.
Clasificación Internacional de Patentes:
- C12N15/52 QUIMICA; METALURGIA. › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Genes que codifican enzimas o proenzimas.
Clasificación PCT:
- C12N15/52 C12N 15/00 […] › Genes que codifican enzimas o proenzimas.
- C12N9/00 C12N […] › Enzimas, p. ej. ligasas (6.); Proenzimas; Composiciones que las contienen (preparaciones para la limpieza de los dientes que contienen enzimas A61K 8/66, A61Q 11/00; preparaciones de uso médico que contienen enzimas A61K 38/43; composiciones detergentes que contienen enzimas C11D ); Procesos para preparar, activar, inhibir, separar o purificar enzimas.
- C12P19/28 C12 […] › C12P PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN ENZIMAS PARA LA SINTESIS DE UN COMPUESTO QUIMICO DADO O DE UNA COMPOSICION DADA, O PARA LA SEPARACION DE ISOMEROS OPTICOS A PARTIR DE UNA MEZCLA RACEMICA. › C12P 19/00 Preparación de compuestos que contienen radicales sacárido (ácido cetoaldónico C12P 7/58). › N-glucósidos.
Fragmento de la descripción:
Procedimiento para aislar genes implicados en la biosíntesis de estreptolidigina, moléculas de ADN, manipulación genética de la ruta y sus usos.
Es objeto de la presente invención un procedimiento de aislamiento y purificación de un fragmento de ácido nucleico que contiene la agrupación de genes de la ruta de biosíntesis de estreptolidigina. La invención también proporciona moléculas de ácido nucleico, moléculas de ácido nucleico recombinante, polipéptidos codificados por estas moléculas, células hospedadoras que contienen estas moléculas y sus usos. La invención también proporciona un proceso para incrementar la producción de metabolitos tetrámicos en un hospedador bacteriano, un proceso para generar derivados de estreptolidigina o precursores de estreptolidigina y sus usos. También es objeto de la invención una cepa recombinante de Streptomyces lydicus y los derivados de estreptolidigina producidos por ella.
La invención resulta de aplicación en la obtención de cepas superproductoras de estreptolidigina o derivados de estreptolidigina para su aislamiento y utilización, entre otros, en el sector farmacéutico o químico para, por ejemplo, su uso como antibiótico en clínica o como reactivo para la investigación, o para el desarrollo de metabolitos tetrámicos o derivados de metabolitos tetrámicos por síntesis química.
Estado de la técnica
La estreptolidigina (Fig. 1), producida por Streptomyces lydicus NRRL 2433 (Deboer et al., Antibiotic. Annual. 3, 886-892,1955) forma parte de la familia de los ácidos tetrámicos que incluye compuestos con un amplio rango de actividades biológicas incluida la actividad antibiótica, antiviral, citotóxica y micotóxica (Royles, Chem. Rev. 95, 1981-2001, 1995). Otros miembros de esta familia son la tirandamicina, ikarugamicina, capsimicina, malonomicina, tirandalidigina, lidicamicina, altiomicina, oleficina, a-lipomicina y tiomicina, todos ellos producidos por diferentes microorganismos del género Streptomyces (Royles, Chem. Rev. 95, 1981-2001,1995). De todos ellos solamente se conoce el agrupamiento génico para la biosínteis a-lipomycin (Bihlmaier et al., Antimicrob. Agents. Chemother. 50, 2113-2121, 2006).
La estreptolidigina es un potente antibiótico inhibidor de la ARN polimerasa bacteriana, interfiriendo con el proceso de elongación de la cadena de ARN naciente, en particular frente a microorganismos Gram-positivos (Deboer et al., Antibiotic. Annual. 3, 886-892,1955; Siddhikol et al., J. Bacteriol. 99, 151-155, 1969; von Meyenburg et al., Antimicrob. Agents. Chemother. 13, 234-243, 1978). Esta actividad ha centrado recientemente nuevos esfuerzos para desentrañar las bases estructurales de la inhibición de la ARN polimerasa bacteriana puesto que la estreptolidigina no inhibe la ARN polimerasa de organismos eucariotas (Tuske et al., Cell 122, 541-552, 2005; Temiakov et al., Mol. Cell. 19, 655-666, 2005). Además de su actividad inhibitoria de la ARN polimerasa bacteriana, se ha mostrado que la estreptolidigina y sus análogos estructurales son potentes inhibidores del enzima desoxi-nucleotidil transferasa terminal (TdT), enzima que se expresa en grandes cantidades en leucocitos de pacientes con leucemia linfoblástica aguda y leucemia mielocítica crónica y que se ha asociado a malos pronósticos en el tratamiento con agentes quimoterápicos y niveles bajos de supervivencia (Dicioccio y Srivastava, Biochem. Biophys. Res. Commun. 72, 1343-1349, 1976; Dicioccio et al., Biochem. Pharmacol. 29, 2001-2008, 1980). Esta actividad ha llevado a considerar a la estreptolidigina y otros compuestos relacionados, tales como la tirandamicina, como potenciales. tratamientos para leucemias con una actividad TDT anormal (TdT+). Este efecto positivo ha sido mostrado para el antimetabolito cordicipina (análogo de nucleósidos) que inhibe la actividad del enzima TdT y además muestra actividad citotóxica in vitro frente a células de leucemia TdT+ y no sobre aquellas TdT (Kodama et al., Biochem. Pharmacol. 59, 273-281, 2000; Foss, Oncology, 14, 31-35, 2000). Además de lo anterior, datos de actividad antitumoral procedentes del National Cancer Institute (Maryland, USA) muestran que la tirandamicina (un análogo estructural de estreptolidigina), presenta actividad antitumoral frente a líneas celulares humanas de cáncer de riñón (RXF 393) y leucemia (CCRF-CEM [TdT+]) a concentraciones inferiores, en dos órdenes de magnitud, a la estreptolidigina. Las principales diferencias estructurales entre estreptolidigina y tirandamicina consisten en la ausencia de un radical L-rodinosa y de una cadena lateral derivada de ácido glutámico en tirandamicina que si están presentes en estreptolidigina. Estas diferencias estructurales hacen de la estreptolidigina un candidato apropiado para la obtención de derivados no glicosilados que puedan presentar una potencial actividad antitumoral.
El desarrollo de la tecnología de ADN recombinante se está convirtiendo en una poderosa herramienta a la hora de incrementar nuestro conocimiento sobre los genes que participan en la biosíntesis de antibióticos. Esta tecnología puede hoy en día ser aplicada a la mejora en los niveles de producción de distintos antibióticos y a la obtención de nuevos compuestos con mejores propiedades farmacocinéticas a través de la combinación de genes de distintas rutas de biosíntesis de antibióticos y su expresión en microorganismos productores de antibióticos, en lo que se ha denominado biosíntesis combinatoria. La tecnología de ADN recombinante ha hecho posible el aislamiento de agrupaciones de genes completas para la biosíntesis de distintos antibióticos utilizando, entre otras estrategias de clonación y selección, el análisis de genotecas de los microorganismos productores de antibióticos mediante sondas de ADN. Esta estrategia se basa en la existencia de información genética previa sobre la ruta de biosíntesis o rutas relacionadas biosintéticamente, lo que permite utilizar o diseñar sondas genéticas a partir de la secuencia total o parcial de un enzima de biosíntesis.
Diferentes estudios sobre la biosíntesis de la estreptolidigina han mostrado la incorporación de propionato, acetato, metionina y ácido glutámico en forma de ácido ß-metilaspártico en la estructura de este compuesto (Chen et al., Org. Left. 8, 5329-5332, 2006; Chen and Harrison, Org. Lett. 6, 4033-4036, 2004; Pearce and Rinehart, J. Antibiot. 36, 1536-1538, 1993; Pearce et al., J. Am. Chem. Soc. 102, 2510-2512, 1980). Estos estudios ya mencionan la posible implicación en la biosíntesis de estreptolidigina de un sistema híbrido que incluiría la participación de una policetido sintasa (PCS) y una sintetasa de péptidos no ribosomales (NRPS), implicación que ha sido demostrada para la biosíntesis de otros ácidos tetrámicos como la a-lipomicina (Bihlmaier et al., Antimicrob. Agents. Chemother. 50, 2113-2121, 2006). En el caso de la estreptolidigina, la especulación sobre la participación de un sistema híbrido PCS-NRPS en su biosíntesis ha sido parcialmente confirmado por la identificación del gen leuTE (número de acceso: DQ115803) que codifica para una tioesterasa tipo II, enzima generalmente asociados a PCSs tipo I (Rawlings, Nat. Prod. Rep. 18, 231-281, 2001), a partir del productor de estreptolidigina Streptomyces lydicus AS 42501. Esta tioesterasa tipo II se ha demostrado, por inactivación génica, implicada en la biosíntesis de estreptolidigina (Yu et al., Appl. Biochem. Biotechnol. 135, 145-158, 2006). Además, la biosíntesis de estreptolidigina ha sido recientemente relacionada con la biosíntesis de ácidos grasos por inactivación de los genes fabCF de Streptomyces lydicus que codifican para una proteína portadora de grupos acilo (ACP) y una ß-cetoacil-ACP sintasa II, respectivamente, implicadas en la síntesis de ácidos grasos. La inactivación de los genes mencionados generó un mutante no productor de estreptolidigina (Zhao et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 83, 305-313, 2009). En la patente "Streptolydigin and production thereof" (U.S. Patent No. 3,160,560) se describe la producción de estreptolidigina a partir de Streptomyces lydicus NRRL 2433. Por otro lado, no se ha encontrado ninguna patente referida a la identificación de los genes implicados en la biosíntesis de estreptolidigina.
Descripción de la invención
Esta invención proporciona una secuencia de genes implicados en la biosíntesis de estreptolidigina y sus precursores. El agrupamiento génico incluye por ejemplo genes estructurales implicados en la biosíntesis de la estructura...
Reivindicaciones:
1. Procedimiento de aislamiento y purificación de un fragmento de ácido nucleico que contiene la agrupación de genes de la ruta de biosíntesis de estreptolidigina que comprende las siguientes etapas:
2. Una molécula de ácido nucleico que comprende:
3. Una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 2, caracterizada porque contiene una parte de la secuencia de nucleótidos con al menos 15 nucleótidos de longitud.
4. Una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 2 que codifica uno o más polipéptidos, o que incluye uno o más elementos genéticos, que poseen una actividad funcional en la síntesis de un antibiótico dienoil-tetrámico o un precursor de un antibiótico dienoil-tetrámico.
5. Una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 2 que codifica uno o más polipéptidos, o incluye uno o más genes y/o una o más secuencias reguladoras y/o uno o más elementos genéticos codificadores o no codificadores, que tienen actividad funcional en la síntesis de un antibiótico dienoil-tetrámico o un precursor de un antibiótico dienoil-tetrámico.
6. Una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 4 ó 5, caracterizada porque dicho antibiótico dienoil-tetrámico o precursor de un antibiótico dienoil-tetrámico es estreptolidigina o un precursor de estreptolidigina.
7. Una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 2 caracterizada por incluir una secuencia de nucleótidos que codifica una o más secuencias de aminoácidos de las descritas en SEQ ID NOs: 2 a 39, o una secuencia de nucleótidos que es complementaria o degenerada con respecto a una secuencia de nucleótidos que codifica una o más secuencias de aminoácidos que poseen al menos un 60% de identidad de secuencia con cualquiera de SEQ ID NOs: 2 a 39.
8. Una molécula de ácido nucleico obtenida según el método de la reivindicación 1 que comprende:
9. Un polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 7 que comprende:
10. Un polipéptido según la reivindicación 9 caracterizado porque posee una actividad funcional en la síntesis de un antibiótico dienoil-tetrámico o un tetrámico.
11. Una molécula de ácido nucleico recombinante caracterizada porque incluye el fragmento de ácido nucleico de la reivindicación 7, o una parte con similares características, clonada en un vector que se replica en Streptomyces o en E. coli.
12. Molécula de ácido nucleico recombinante de acuerdo a la reivindicación 11 caracterizada porque es el cósmido Slg6E5.
13. Molécula de ácido nucleico recombinante de acuerdo a la reivindicación 11 caracterizada porque es el cósmido Slg4A8.
14. Molécula de ácido nucleico recombinante de acuerdo a la reivindicación 11 caracterizada porque es el cósmido Slg9C7.
15. Molécula de ácido nucleico recombinante de acuerdo a la reivindicación 11 caracterizada porque es el cósmido Slg6G6.
16. Célula hospedadora u organismo transgénico caracterizado porque contiene una molécula de ácido nucleico recombinante de las reivindicaciones 11, 12, 13, 14 ó 15.
17. Utilización de los genes codificados por el fragmento de ácido nucleico de las reivindicaciones 7 u 11 en la producción de metabolitos tetrámicos.
18. Utilización de los genes codificados por el fragmento de ácido nucleico de las reivindicaciones 7 u 11 en la producción de estreptolidigina, derivados de estreptolidigina o precursores de estreptolidigina.
19. Utilización de los genes codificados por el fragmento de ácido nucleico de las reivindicaciones 7 u 11 para incrementar la producción de metabolitos tetrámicos o precursores de metabolitos tetrámicos.
20. Utilización de los genes codificados por el fragmento de ácido nucleico de las reivindicaciones 7 u 11 para incrementar la producción de estreptolidigina, derivados de estreptolidigina o precursores de estreptolidigina.
21. Utilización de una molécula de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 7 u 11, en la inactivación de genes implicados en la biosíntesis de estreptolidigina.
22. Utilización de una molécula de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 7 u 11, en técnicas de amplificación por PCR encaminadas al aislamiento y/o utilización de genes implicados en la biosíntesis de estreptolidigina.
23. Utilización de células hospedadoras u organismos transgénicos de la reivindicación 16, en la producción de metabolitos tetrámicos.
24. Utilización de células hospedadoras u organismos transgénicos, de la reivindicación 16, en la producción de estreptolidigina, derivados de estreptolidigina o precursores de estreptolidigina.
25. Uso de los intermediarios de estreptolidigina o derivados de estreptolidigina de las reivindicaciones 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 ó 24 como compuestos de partida en la síntesis química de metabolitos tetrámicos.
26. Proceso para incrementar la producción de metabolitos tetrámicos en un hospedador bacteriano, que comprende las siguientes etapas:
27. Proceso según la reivindicación 26 caracterizado porque el hospedador del género Streptomyces es Streptomyces lydicus.
28. Proceso según la reivindicación 27 caracterizado porque el hospedador Streptomyces lydicus es un mutante derivado de S. lydicus NRRL 2433.
29. Proceso según las reivindicaciones 28, caracterizado porque el metabolito tetrámico es estreptolidigina, un derivado de estreptolidigina o un precursor de estreptolidigina.
30. Proceso para generar derivados de estreptolidigina o precursores de estreptolidigina caracterizado por la inactivación de genes codificados por el fragmento de ácido nucleico de las reivindicaciones 7 u 11.
31. Uso de los intermediarios de estreptolidigina o derivados de estreptolidigina obtenidos de las reivindicaciones 26, 27, 28 29 6 30 como compuestos de partida en la síntesis química de productos tetrámicos.
32. Cepa recombinante de Streptomyces lydicus caracterizada porque carece de los genes que codifican para las proteínas descritas como SEQ ID NO: 8, 9, 10, 11 y 12.
33. Cepa recombinante de Streptomyces lydicus de la reivindicación 32 caracterizada porque contiene el plásmido pFL844T.
34. Cepa recombinante de Streptomyces lydicus de la reivindicación 32 caracterizada porque contiene el plásmido pFL845T.
35. Cepa recombinante de Streptomyces lydicus de la reivindicación 32 caracterizada porque contiene el plásmido pLNBIVT.
36. Derivados de estreptolidigina caracterizados porque se producen por la cepa de la reivindicación 32, 33, 34 ó 35.
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