Un método in vitro para disminuir la activación de la miostatina,

que comprende poner en contacto una muestra que comprende un complejo de miostatina latente que comprende un propéptido de miostatina y un fragmento C-terminal de miostatina, y una metaloproteinasa que puede escindir el propéptido de miostatina, con un agente que disminuye la escisión proteolítica del propéptido a través de la metaloproteinasa, disminuyendo de este modo la activación de la miostatina

en donde la metaloproteinasa en un miembro de la familia de proteínas morfogenéticas óseas 1/toloides (BMP-1/TLD) y el agente es un péptido seleccionado entre el grupo consistente en SEQ ID NOs: 11, 14, 17, 20 y 23

Activación de miostatina por metaloproteasa, y métodos para modular la actividad de miostatina.

Antecedentes de la invención

La invención se refiere en general a la regulación con metaloproteinasas de la actividad de la miostatina, y más específicamente, a métodos para emplear agonistas o antagonistas de la familia de metaloproteinasas BMP-1/TLD para modular la actividad de la miostatina, que incluyen, por ejemplo, regular el desarrollo muscular en un organismo, métodos para identificar agonistas y antagonistas de tales metaloproteinasas y los agonistas y los antagonistas identificados de este modo.

La miostatina es un miembro de la familia de factores de crecimiento de transformación ß (TGF-ß) que es esencial para una regulación adecuada del crecimiento del músculo esquelético. La miostatina es una proteína secretada que se expresa de manera específica en las células de la estirpe del músculo esquelético, durante el desarrollo embrionario y en animales adultos; en células adiposas de animales adultos también hay niveles bajos de ARNm de miostatina. Durante la embriogénesis temprana, el ARNm de la miostatina se puede detectar en el miotomo de las somitas en desarrollo. En las etapas embrionarias tardías y en la vida postnatal, la miostatina se expresa generalmente en todos los músculos esqueléticos que se han examinado.

La función de la miostatina fue determinada mediante estudios en ratones de direccionamiento génico hacia una diana. Los ratones que carecen de miostatina mostraron un incremento extendido y espectacular de la masa muscular esquelética, debido a una hiperplasia e hipertrofia de las fibras musculares, indicando que la miostatina es un regulador negativo del crecimiento muscular. El gen de la miostatina está muy conservado a lo largo de la evolución, siendo la secuencia que se predecía para la proteína de miostatina madura, idéntica entre ratones, ratas, seres humanos, pollos, pavos y cerdos, y muy homóloga incluso en relación con organismos acuáticos. La función de la miostatina también está conservada, correlacionándose las mutaciones en el gen de la miostatina con el fenotipo de doble musculatura en el ganado.

El papel de la miostatina en la regulación del crecimiento y del desarrollo muscular indica que los métodos y las composiciones que regulan la actividad de la miostatina pueden tener una amplia variedad de aplicaciones, incluyendo, por ejemplo, el tratamiento de enfermedades humanas y la mejora de la producción ganadera. En relación con las aplicaciones terapéuticas humanas, los inhibidores de la expresión o de la función de la miostatina pueden aportar un beneficio clínico en el tratamiento de trastornos de desgaste muscular, tales como distrofia muscular, caquexia y sarcopenia. Además, los animales que carecen de miostatina, tienen una reducción significativa de la acumulación de grasa, y la pérdida de miostatina protege contra el desarrollo de obesidad y de diabetes de tipo 2 en modelos genéticos en ratones. Así, la modulación de la actividad de la miostatina también puede ser útil en el tratamiento de trastornos metabólicos, tales como la obesidad y la diabetes de tipo 2. Además, a este respecto, los inhibidores de la expresión o de la función de miostatina no sólo pueden ser útiles para incrementar la eficacia de la producción ganadera, sino que también pueden tener como resultado la producción de carne con menos contenido en grasa.

Se han descrito diversas estrategias para manipular las actividades biológicas de la miostatina. La miostatina se sintetiza como una proteína precursora que experimenta un procesamiento proteolítico para generar un fragmento N-terminal, denominado el fragmento "propéptido" y un fragmento C-terminal, un dímero enlazado con disulfuro, que es la especie biológicamente activa. Las estrategias descritas en la actualidad para inhibir la actividad de la miostatina, han utilizado moléculas que se pueden unir al dímero C-terminal de la miostatina e inhibir su actividad. Por ejemplo, la miostatina se une a dos receptores de activina de tipo II, Act RIIA y Act RIIB, in vitro, y la expresión de una forma negativa, dominante y truncada de Act RIIB en ratones transgénicos, dio como resultado que los ratones tenían incrementos en la masa muscular, comparables a los de ratones transgénicos desprovistos del gen de miostatina.

El propéptido de la miostatina también se ha utilizado para inhibir la actividad de la miostatina. Después del procesamiento proteolítico, el propéptido de la miostatina permanece asociado no covalentemente con el dímero C-terminal y mantiene el dímero en un estado latente e inactivo. Se ha observado que el propéptido bloquea la actividad del dímero C-terminal purificado de la miostatina en diversos ensayos in vitro, y la hiperexpresión del propéptido en ratones transgénicos daba como resultado un fenotipo característico de la mutación nula en miostatina. La folistatina es otra proteína que actúa como inhibidor de la miostatina. La folistatina puede unirse a una variedad de miembros de la familia de TGF-ß, que incluyen la miostatina, e inhibir su actividad, y ratones transgénicos que hiperexpresan la folistatina en el músculo, tienen un incremento extraordinario del crecimiento muscular, lo que concuerda con la inhibición de la actividad de la miostatina.

Los inhibidores de la miostatina descritos anteriormente, interaccionan específicamente cada uno con la miostatina madura para inhibir su actividad. Aunque la inhibición de la actividad de una proteína tal como la miostatina, empleando un agente que interacciona directamente con la proteína, proporciona una gran especificidad, dicho método puede requerir que todas o la mayoría de las proteínas estén unidas al agente para que se manifieste el efecto inhibidor. Una vía alternativa para inhibir la actividad de una proteína, particularmente de una proteína que ella misma debe ser activada con una segunda proteína, tal como una enzima, para que la primera proteína sea funcional, es poner como diana la segunda proteína. Dicho método puede ser ventajoso porque las proteínas activadoras, tales como enzimas, están presentes generalmente en niveles muy inferiores a los de sus sustratos. De este modo, hay una mayor probabilidad de que toda o una gran parte de la proteína activadora, tal como una enzima, pueda ser inhibida.

En relación con la miostatina, se conocen al menos dos proteasas implicadas en el procesamiento de la promiostatina, el producto primario del gen, en un péptido señal, un propéptido y un fragmento C-terminal, el último de los cuales forma homodímeros que tienen la actividad biológica de la miostatina. Desafortunadamente, estas proteasas también pueden actuar sobre una variedad de proteínas diferentes y, por tanto, sobre agentes que se dirigen hacia esas proteasa y las inhiben, por ejemplo, la peptidasa señal, y tendrían probablemente diversos efectos nocivos si se administran a un organismo vivo. Por tanto, existe una necesidad de identificar moléculas biológicas que estén implicadas más específicamente en la regulación de la activación y la actividad de la miostatina. La presente invención satisface esta necesidad y proporciona unas ventajas adicionales.

En la técnica anterior, Huet y col., Am. J. Physiol. Cell Physiol., 281:C1624-C-1634, 2001, describen que células tratadas con inhibidores de metaloproteinasas basados en hidroxamato, han reducido la cantidad de miostatina madura y sugieren que las metaloproteinasas están implicadas en la regulación y la diferenciación del crecimiento del músculo esquelético. El documento WO-A-02/09641 describe porciones de péptido sustancialmente purificadas de un polipéptido de promiostatina.

IBC, artículo en prensa, manuscrito M206379200 (22-08-2002) describe el uso del propéptido de miostatina y de folistatina para unirse al dímero C-terminal de miostatina e inhibir de este modo su actividad.

Sumario de la invención

La presente invención se basa en la identificación de proteasas que escinden el propéptido de miostatina, incluyendo cuando el propéptido de miostatina está presente en un complejo con un dímero C-terminal de miostatina. De este modo, las proteasas pueden convertir un complejo de miostatina inactivo y latente, que comprende un propéptido de miostatina asociado con un polipéptido de miostatina C-terminal, en miostatina activa que es un regulador negativo del crecimiento y del desarrollo muscular. Tales proteasas que se ilustran con metaloproteinasas de la familia de proteínas morfogenéticas...

1. Un método in vitro para disminuir la activación de la miostatina, que comprende poner en contacto una muestra que comprende un complejo de miostatina latente que comprende un propéptido de miostatina y un fragmento C-terminal de miostatina, y una metaloproteinasa que puede escindir el propéptido de miostatina, con un agente que disminuye la escisión proteolítica del propéptido a través de la metaloproteinasa, disminuyendo de este modo la activación de la miostatina

en donde la metaloproteinasa en un miembro de la familia de proteínas morfogenéticas óseas 1/toloides (BMP-1/TLD) y el agente es un péptido seleccionado entre el grupo consistente en SEQ ID NOs: 11, 14, 17, 20 y 23.

2. El método según la reivindicación 1, en el que el miembro de la familia BMP-1/TLD es BMP-1, TLD, la proteína 1 similar a toloide (TLL-1) o la proteína 2 similar a toloide (TLL-2).

3. El método según la reivindicación 2, en el que el miembro de la familia BMP-1/TLD es TLD de mamífero (mTLD), TLL-1 de mamífero (mTLL-1) o TLL-2 de mamífero (mTLL-2).

4. El método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la muestra comprende una muestra celular, una muestra tisular o una muestra de fluido biológico.

5. Un agente que disminuye la escisión proteolítica con una metaloproteinasa de un propéptido de miostatina en un complejo de miostatina que comprende el propéptido de miostatina y un fragmento C-terminal de miostatina, para emplear en la disminución de la activación de miostatina en un individuo,

en donde la metaloproteinasa es un miembro de la familia de proteínas morfogenéticas óseas 1/toloides (BMP-1/TLD) y el agente es un péptido seleccionado entre el grupo consistente en SEQ ID NOs: 11, 14, 17, 20 y 23.

6. El agente según la reivindicación 5, en donde el miembro de la familia BMP-1/TLD es BMP-1, TLD, la proteína 1 similar a toloide (TLL-1) o TLL-2.

7. El agente según la reivindicación 6, en donde el miembro de la familia BMP-1/TLD es TLD de mamífero (mTLD), TLL-1 de mamífero (mTLL-1) o TLL-2 de mamífero (mTLL-2).

8. El agente según la reivindicación 5, 6 ó 7, en donde, en el individuo, la masa muscular se incrementa y/o el contenido en grasa disminuye.

9. El agente según la reivindicación 8, en donde el individuo es un animal criado como fuente de alimentos.

10. El agente según la reivindicación 5, 6 ó 7, en donde, en el individuo, se alivia un trastorno metabólico.

11. El agente según la reivindicación 10, en donde el trastorno metabólico es obesidad, diabetes de tipo 2 o es un trastorno de desgaste muscular.

12. El agente según la reivindicación 11, en el que el trastorno de desgaste muscular es sarcopenia o está asociado con la distrofia muscular o con la caquexia.

13. El agente según la reivindicación 12, en donde la caquexia está asociada con el cáncer o con la inmunodeficiencia adquirida.

14. El agente según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, en donde el individuo es un vertebrado..

15. El agente según la reivindicación 14 cuando está agregada a una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, en donde el individuo vertebrado es un animal doméstico.

16. El agente según la reivindicación 9 o la reivindicación 14, en donde el individuo es una especie de mamífero, una especie aviar o una especie piscícola.

17. El agente según la reivindicación 16, en donde la especie de mamífero es una especie ovina, una especie porcina, una especie bovina o un ser humano.

18. El agente según la reivindicación 17, en donde la especie aviar es un pollo o un pavo.

19. Un método in vitro para identificar un agente que modula la activación de la miostatina latente mediada con una metaloproteinasa, que comprende:

a) poner en contacto un propéptido de miostatina, una metaloproteinasa que puede escindir el propéptido de miostatina y un agente del ensayo, bajo condiciones suficientes para que tenga lugar la escisión del propéptido con la metaloproteinasa; y

b) detectar un cambio en la cantidad de escisión del propéptido en ausencia del agente del ensayo, comparando con la presencia del agente del ensayo, identificando de este modo el agente del ensayo como un agente que modula la activación mediada con metaloproteinasa de la miostatina latente,

en donde la metaloproteinasa es un miembro de la familia de proteínas morfogenéticas óseas 1/toloides (BMP-1/TLD).

20. El método según la reivindicación 19, en donde el propéptido de la miostatina comprende un complejo de miostatina latente que comprende el propéptido de miostatina y un fragmento C-terminal de la miostatina.

21. El método según la reivindicación 19, en donde el propéptido de la miostatina comprende un complejo de miostatina latente que comprende el propéptido de miostatina y un dímero C-terminal de la miostatina.

22. El método según la reivindicación 19, en donde detectar una diferencia en la cantidad de escisión del propéptido comprende detectar el propéptido o un producto de la escisión del propéptido.

23. El método según la reivindicación 22, en donde la cantidad de propéptido o de producto de la escisión del propéptido se detecta mediante electroforesis, cromatografía o espectrometría de masas.

24. El método según la reivindicación 22, que comprende detectar una cantidad incrementada de un producto de la escisión del propéptido en presencia del agente del ensayo comparada con una cantidad del producto de la escisión en ausencia del agente del ensayo, identificando de este modo el agente del ensayo como un agente que incrementa la activación mediada con metaloproteinasa de la miostatina latente.

25. El método según la reivindicación 22, que comprende detectar una cantidad disminuida del propéptido en presencia del agente del ensayo, comparada con una cantidad de propéptido en ausencia del agente del ensayo, identificando de este modo el agente del ensayo como un agente que incrementa la activación mediada con metaloproteinasa de la miostatina latente.

26. El método según la reivindicación 22, que comprende detectar una cantidad disminuida de un producto de la escisión del propéptido en presencia del agente del ensayo, comparada con una cantidad del producto de la escisión en ausencia del agente del ensayo, identificando de este modo el agente del ensayo como un agente que disminuye la activación mediada con metaloproteinasa de la miostatina latente.

27. El método según la reivindicación 22, que comprende detectar una cantidad mayor de un propéptido en presencia del agente del ensayo, comparada con una cantidad de propéptido en ausencia del agente del ensayo, identificando de este modo el agente del ensayo como un agente que disminuye la activación mediada con metaloproteinasa de la miostatina latente.

28. El método según la reivindicación 19, que comprende adicionalmente la determinación de una cantidad con la que el agente modula la activación mediada con metaloproteinasa de la miostatina latente.

29. El método según la reivindicación 22, en donde la detección de una diferencia en la cantidad de escisión del propéptido comprende detectar un cambio en la transducción de la señal mediada con miostatina en una célula que expresa un receptor de miostatina.

30. El método según la reivindicación 29, en donde el receptor de la miostatina es un receptor de activina.

31. El método según la reivindicación 30, en donde el receptor de activina es un receptor de activina de tipo II.

32. El método según la reivindicación 29, en donde el receptor de la miostatina es expresado por un transgén.

33. El método según la reivindicación 29, en donde la célula contiene un gen informador sensible a la transducción de la señal mediada con miostatina, y en donde dicha detección comprende detectar un cambio en la expresión del gen informador.

34. El método según la reivindicación 33, en donde el gen informador comprende un elemento regulador del factor de crecimiento de transformación beta (TGF-ß).

35. El método según la reivindicación 19, en donde el agente del ensayo es un péptido, un hidroxamato de péptido, un péptido fosfínico, un peptoide, un polinucleótido o una molécula orgánica pequeña.

36. El método según la reivindicación 19, que se realiza en un formato de alto rendimiento.

37. El método según la reivindicación 36, que comprende poner en contacto cada una de una variedad de muestras que comprenden un propéptido de miostatina y una metaloproteinasa, con un agente del ensayo.

38. El método según la reivindicación 36, en donde el agente del ensayo comprende una variedad de agentes del ensayo, y en donde al menos una muestra que comprende un propéptido de miostatina y una metaloproteinasa entre una variedad de muestras, se pone en contacto con al menos un agente del ensayo entre una variedad de agentes del ensayo.

39. El método según la reivindicación 38, en donde la variedad de agentes del ensayo comprende una quimioteca combinatoria de agentes del ensayo.

40. El método según la reivindicación 39, en donde la quimioteca combinatoria de agentes del ensayo comprende una quimioteca de agentes del ensayo aleatoria, de agentes del ensayo sesgados o de agentes del ensayo diversificados.