ENSAYO PARA DETECTAR EL ESTADO DE METILACION POR EXTENSION CON INICIADORES ESPECIFICOS DE METILACION (MSPE).
Un método de detección de la metilación en 5'' del DNA en un residuo citosina de un sitio CpG en una secuencia de ácido nucleico,
que comprende:# (a) obtener DNA de una muestra a analizar; #(b) poner en contacto el DNA con un compuesto bisulfítico; #(c) amplificar el DNA utilizando iniciadores específicos de cadena; #(d) realizar una reacción de extensión con iniciadores utilizando al menos un par de iniciadores de metilación específicos de extensión con iniciadores (MSPE) que se hibridan a la cadena superior del DNA amplificado, dNTPs marcados, y una DNA-polimerasa, en donde el extremo 3'' del primer iniciador MSPE del par comprende una secuencia de polinucleótidos que es específica para la cadena superior del DNA metilado, el residuo terminal 3'' del iniciador se hibrida al residuo citosina del sitio CpG a analizar, y el extremo 5'' de dicho primer iniciador MSPE comprende una primera secuencia exclusiva que no se hibrida a secuencia de DNA alguna contenida en la muestra; en donde el extremo 3'' del segundo iniciador MSPE del par comprende una secuencia de polinucleótidos que es específica para la cadena superior de la secuencia de DNA no metilada, el residuo terminal 3'' del iniciador se hibrida al residuo timina que se deriva de la citosina del sitio CpG a analizar, y el extremo 5'' de dicho segundo iniciador MSPE comprende una segunda secuencia exclusiva que no se hibrida a secuencia de DNA alguna contenida en la muestra; #(e) hibridar los productos de extensión con iniciadores de (d) a al menos un par de oligonucleótidos, en donde el primer oligonucleótido del par es complementario a dicha primera secuencia exclusiva, y el segundo oligonucleótido del par es complementario a dicha segunda secuencia exclusiva; y #(f) determinar el estado de metilación en 5'' en el residuo citosina del sitio CpG por comparación de la intensidad de hibridación del DNA metilado con la intensidad de hibridación del DNA no metilado en la muestra; o en donde (d) la reacción de extensión con iniciadores se realiza utilizando al menos un par de iniciadores MSPE que se hibridan a la cadena inferior del DNA amplificado, dNTPs marcados, y una DNA-polimerasa, en donde el extremo 3'' del primer iniciador MSPE del par comprende una secuencia de polinucleótidos que es específica para la cadena inferior del DNA metilado, el residuo Terminal 3'' del iniciador se hibrida al residuo guanina complementario a la citosina del sitio CpG en la cadena superior, y el extremo 5'' de dicho primer iniciador MSPE comprende una primera secuencia exclusiva que no se hibrida a secuencia alguna de DNA existente en la muestra; en donde el extremo 3'' del segundo iniciador MSPE del par comprende una secuencia de polinucleótidos que es específica para la cadena inferior de la secuencia de DNA no metilada, el residuo Terminal 3'' del iniciador se hibrida al residuo adenina que se deriva de la citosina del sitio CpG en la cadena superior, y el extremo 5'' de dicho segundo iniciador MSPE comprende una segunda secuencia exclusiva queno se hibrida a secuencia alguna de DNA existente en la muestra; o en donde (d) la reacción de extensión con iniciadores se realiza utilizando al menos un par de iniciadores de metilación específicos de extensión con iniciadores (MSPE) que se hibridan a la cadena superior del DNA amplificado, dNTPs, ddCTP marcado y una DNA-polimerasa, en donde el extremo 3'' del primer iniciador MSPE del par comprende una secuencia de polinucleótidos que es específica para la cadena superior del DNA metilado, el residuo terminal 3'' del iniciador se hibrida al residuo citosina del sitio CpG a analizar, y el extremo 5'' de dicho primer iniciador MSPE comprende una primera secuencia exclusiva que no se hibrida a secuencia alguna de DNA existente en la muestra; en donde el extremo 3'' del segundo iniciador MSPE del par comprende una secuencia de polinucleótidos que es específica para la cadena superior de la secuencia de DNA no metilada, el residuo terminal 3'' del iniciador se hibrida al residuo timina que se deriva de la citosina en el sitio CpG a analizar, y el extremo 5'' de dicho segundo iniciador MSPE comprende una segunda secuencia exclusiva que no se hibrida a secuencia de DNA alguna en la muestra; o en donde (d) la reacción de extensión con iniciadores se realiza utilizando al menos un par de iniciadores de metilación específicos de extensión con iniciadores (MSPE) que se hibridan a la cadena superior del DNA amplificado, mezcla de dNTPs y ddNTPs marcados, mezcla de dNTPs y ddNTPs sin marcar, y una DNA-polimerasa, en donde el extremo 3'' del primer iniciador MSPE del par comprende una secuencia de polinucleótidos que es específica para la cadena superior del DNA metilado, el residuo terminal 3'' del iniciador se hibrida al residuo citosina del sitio CpG a analizar, y el extremo 5'' de dicho primer iniciador MSPE comprende una primera secuencia exclusiva que no se hibrida a secuencia alguna de DNA existente en la muestra; en donde el extremo 3'' del segundo iniciador MSPE del par comprende una secuencia de polinucleótidos que es específica para la cadena superior de la secuencia de DNA no metilada, el residuo terminal 3'' del iniciador se hibrida al residuo timina que se deriva de la citosina en el sitio CpG a analizar, y el extremo 5'' de dicho segundo iniciador MSPE comprende una segunda secuencia exclusiva que no se hibrida a secuencia alguna de DNA existente en la muestra.
Tipo: Resumen de patente/invención.
Solicitante: BAYER HEALTHCARE LLC.
Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.
Dirección: 511 BENEDICT AVENUE,TARRYTOWN N.Y. 10591.
Inventor/es: LI,ZHENG, HARVEY,JEANNE.
Fecha de Publicación: .
Fecha Solicitud PCT: 16 de Diciembre de 2004.
Fecha Concesión Europea: 28 de Febrero de 2007.
Clasificación PCT:
- C12M1/00 QUIMICA; METALURGIA. › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12M EQUIPOS PARA ENZIMOLOGIA O MICROBIOLOGIA (instalaciones para la fermentación de estiércoles A01C 3/02; conservación de partes vivas de cuerpos humanos o animales A01N 1/02; aparatos de cervecería C12C; equipos para la fermentación del vino C12G; aparatos para preparar el vinagre C12J 1/10). › Equipos para enzimología o microbiología.
- C12N15/09 C12 […] › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Tecnología del ADN recombinante.
- C12P19/34 C12 […] › C12P PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN ENZIMAS PARA LA SINTESIS DE UN COMPUESTO QUIMICO DADO O DE UNA COMPOSICION DADA, O PARA LA SEPARACION DE ISOMEROS OPTICOS A PARTIR DE UNA MEZCLA RACEMICA. › C12P 19/00 Preparación de compuestos que contienen radicales sacárido (ácido cetoaldónico C12P 7/58). › Polinucleótidos, p. ej. ácidos nucleicos, oligorribonucleótidos.
- C12Q1/68 C12 […] › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen ácidos nucleicos.
Países PCT: Austria, Bélgica, Suiza, Alemania, Dinamarca, España, Francia, Reino Unido, Grecia, Italia, Liechtensein, Luxemburgo, Países Bajos, Suecia, Mónaco, Portugal, Irlanda, Eslovenia, Finlandia, Rumania, Chipre, Lituania, Letonia, Ex República Yugoslava de Macedonia, Albania.
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