Una biblioteca de pares análogos que comprende secuencias de ácido nucleico unidas que codifican la región variable,

en la que cada par análogo es un par original de secuencias de ácido nucleico no contiguas amplificadas a partir de un único linfocito, estando presente la biblioteca en una pluralidad de recipientes en la que cada recipiente contiene un único par análogo.

Procedimiento para unir secuencias de interés Campo técnico de la invención La presente invención se refiere a un procedimiento de amplificación molecular múltiplex que puede unir secuencias de nucleótidos de interés en relación con la amplificación, en particular la reacción en cadena de la polimerasa (PCR múltiplex) . El procedimiento es particularmente ventajoso para la generación de bibliotecas de pares análogos de secuencias que codifican regiones variables a partir de inmunoglobulinas.

Antecedentes de la invención

Las proteínas de unión a antígeno implicadas en la respuesta inmunitaria están presentes en mamíferos como grandes repertorios policlonales que representan una amplia diversidad de especificidades de unión. Esta diversidad se genera mediante la transposición de secuencias génicas que codifican regiones variables de estas proteínas de unión. Tales proteínas de unión a regiones variables incluyen formas solubles y unidas a membrana del receptor de las células B (también conocidas como inmunoglobulinas o anticuerpos) y receptores de células T (RcT) unidos a membrana. Con respecto a las inmunoglobulinas, su afinidad se potencia posteriormente al reconocimiento de un antígeno por un receptor de antígeno de células B, a través de un proceso denominado maduración de la afinidad que implica ciclos de hipermutación somática de estos genes variables.

De manera destacada, las inmunoglobulinas o fragmentos de las mismas, tales como fragmentos Fab, fragmentos Fv y moléculas Fv de cadena sencilla (scFv) , se han sometido a clonación y expresión recombinante. Sin embargo, todas las otras proteínas de unión a la región variable en principio también pueden clonarse y expresarse usando los mismos conceptos que para los anticuerpos.

Enfoques conocidos para aislar anticuerpos con una especificidad de unión deseada implican de la manera más frecuente la generación de hibridomas a partir de huéspedes inmunizados seguido por la exploración para seleccionar clones específicos o implican la generación de bibliotecas de expresión combinatorias en E. coli compuesta de dominios variables de inmunoglobulinas, que se enriquecen posteriormente usando técnicas tales como, por ejemplo presentación en fago.

La restricción principal en el uso de la tecnología de hibridoma para preparar anticuerpos terapéuticos es la ausencia de un linfoma humano adecuado como componentes de fusión para los linfocitos B humanos. Los heterohibridomas (es decir, fusión de células B humanas con linfomas de ratón) son notoriamente inestables y por tanto rara vez conducen a líneas celulares adecuadas para fines de producción. Las células B humanas inmortalizadas a través de la infección con el virus Epstein-Barr muestran problemas similares de inestabilidad. La ausencia de metodología celular sólida para preparar anticuerpos humanos para tratamiento puede compensarse con ventajas más recientes en biología molecular.

El uso de bibliotecas combinatorias y presentación en fago permite la generación de grandes repertorios de clones de anticuerpos con una posible diversidad en exceso de 1010. A partir de esto puede realizarse una selección de repertorio para la unión a una diana específica, generando de ese modo una subbiblioteca. Esta subbiblioteca puede usarse para generar anticuerpos monoclonales o bien policlonales. Las secuencias que codifican la región variable (por ejemplo las secuencias que codifican la región variable de cadena ligera y la región variable de cadena pesada de inmunoglobulinas) que constituyen la biblioteca pueden amplificarse a partir de linfocitos, células plasmáticas, hibridomas o cualquier otra población de células que expresa inmunoglobulinas. Las tecnologías actuales para generar bibliotecas combinatorias implican el aislamiento separado de las secuencias que codifican la región variable a partir de una población de células. Por tanto, se perderá el apareamiento original de, por ejemplo, las secuencias que codifican la región variable de cadena ligera y la región variable de cadena pesada de inmunoglobulinas. Más bien, en una biblioteca combinatoria, dichas secuencias están apareadas aleatoriamente y las combinaciones originales de estas secuencias variables sólo se producirán por casualidad. Por tanto, con el fin de aislar secuencias que codifican la región variable responsables de una especificidad de unión deseada, es necesaria una cantidad considerable de exploración. Normalmente esto se realiza en combinación con procedimientos para enriquecer clones que muestran una especificidad deseada, tales como presentación en ribosoma o presentación en fago. Incluso entonces, la diversidad conseguida podría no ser lo suficientemente grande para aislar pares de secuencias que codifican la región variable dando origen a proteínas de unión de alta afinidad similar a las encontradas en las células originales. Además, los procedimientos de enriquecimiento usados normalmente para seleccionar bibliotecas combinatorias introducen un gran error sistemático por ejemplo para polipéptidos de baja toxicidad particular en E. coli, un plegado eficaz, constantes de disociación lentas, u otros parámetros dependientes del sistema, que reducen la diversidad de la biblioteca incluso más. Además, los clones derivados de tales bibliotecas combinatorias serán más propensos a producir proteínas de unión con reactividad cruzada frente a autoantígenos porque como pares, al contrario que los pares originales (denominados a continuación en el presente documento pares análogos) , nunca han pasado la selección negativa in vivo frente a autoantígenos, tal como es el caso de los receptores de linfocitos B y T durante las fases particulares de su desarrollo. Por tanto, la clonación de pares originales de las secuencias que codifican la región variable es un enfoque deseable. Además, se espera que la frecuencia de clones que muestran una especificidad de unión deseada sea considerablemente superior dentro de una biblioteca de pares análogos, que en una biblioteca combinatoria convencional, particularmente si las células de material de partida se derivan de un donante con alta frecuencia de células que codifican pares de unión específica, por ejemplo donantes inmunitarios o inmunizados. Se cumple que el tamaño de una biblioteca de pares análogos no necesitará ser tan grande como una biblioteca combinatoria: una biblioteca de pares análogos de tamaño de 104 clones a 105 clones o incluso tan pequeña como de 102 clones a 103 clones derivada de un donante con una respuesta inmunitaria continua relevante, podría ser suficiente con el fin de obtener proteínas de unión que representan una amplia diversidad de especificidades de unión.

Con el fin de generar bibliotecas de pares análogos, se requiere la unión de las secuencias que codifican la región variable derivadas de la misma célula. Actualmente, se han descrito dos enfoques diferentes que pueden conseguir apareamiento análogo de secuencias que codifican la región variable.

La PCR en célula es un enfoque en el que una población de células se fija y permeabiliza, seguido por la unión en célula de las secuencias que codifican la región variable de cadena ligera y la región variable de cadena pesada de inmunoglobulinas. Esta unión puede realizarse mediante RT-PCR de extensión por solapamiento (documento WO 93/03151) o mediante recombinación (Chapal, N. y col. 1997 BioTechniques 23, 518-524) . El proceso de amplificación según se describe en estas publicaciones es un proceso de tres o cuatro etapas que consiste en i) transcripción inversa que usa cebadores de región constante que generan ADNc de inmunoglobulinas, ii) amplificación por PCR de las secuencias que codifican la región variable de cadena ligera y pesada que usa conjuntos de cebadores que contienen sitios de recombinación o bien de diseño de extensión por solapamiento, iii) unión mediante recombinación, si se elige este enfoque, iv) PCR anidada de los productos que generan sitios de restricción para la clonación. Puesto que las células se permeabilizan existe un riesgo considerable de que los productos de amplificación pudieran salirse de las células, introduciendo de ese modo aleatorizaciones de las secuencias que codifican la región variable de cadena ligera y la región variable de cadena pesada, dando como resultado la pérdida del apareamiento análogo. Por tanto, el procedimiento incluye etapas de lavado tras cada reacción que hace el proceso laborioso y reduce la eficacia de las reacciones.

De manera más general, la PCR en célula es notoriamente ineficaz, dando como resultado baja sensibilidad. Por consiguiente, la técnica... [Seguir leyendo]

1. Una biblioteca de pares análogos que comprende secuencias de ácido nucleico unidas que codifican la región variable, en la que cada par análogo es un par original de secuencias de ácido nucleico no contiguas amplificadas a partir de un único linfocito, estando presente la biblioteca en una pluralidad de recipientes en la que cada recipiente contiene un único par análogo.

2. La biblioteca de la reivindicación 1, comprendiendo la biblioteca al menos 10 pares análogos diferentes.

3. La biblioteca de la reivindicación 1, comprendiendo la biblioteca al menos 20 pares análogos diferentes.

4. La biblioteca de la reivindicación 1, comprendiendo la biblioteca al menos 50 pares análogos diferentes.

5. La biblioteca de la reivindicación 1, comprendiendo la biblioteca al menos 100 pares análogos diferentes.

6. La biblioteca de la reivindicación 1, comprendiendo la biblioteca al menos 1000 pares análogos diferentes.

7. La biblioteca de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que los pares análogos comprenden una secuencia que codifica la región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina unida a una secuencia que codifica la región variable de la cadena ligera.

8. La biblioteca según la reivindicación 7, en la que los pares análogos comprenden una secuencia que codifica la región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina unida a una secuencia que codifica la región variable de la cadena ligera, y dichas secuencias se insertan en marco dentro de un vector que contiene secuencias que codifican al menos un dominio constante de inmunoglobulina o un fragmento del mismo.

9. La biblioteca según una de las reivindicaciones anteriores, en la que el vector es un vector de expresión de mamífero.

10. La biblioteca según la reivindicación 9, en la que el vector de expresión de mamífero codifica al menos un dominio de región constante seleccionado de las clases de inmunoglobulina humana IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, cadena ligera kappa y cadena ligera lambda, o de las cadenas alfa, beta, delta, gamma del receptor de células T humano.

11. La biblioteca según la reivindicación 10, en la que dicho vector de expresión de mamífero que comprende los pares análogos individuales codifica un anticuerpo de longitud completa seleccionado de las clases de inmunoglobulina humana IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 y IgM.

12. La biblioteca según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, siendo dicha biblioteca una subbiblioteca que comprende un subconjunto de pares análogos específicos de diana de secuencias unidas de región variable que codifican proteínas de unión con una especificidad de diana deseada.

13. La subbiblioteca según la reivindicación 12, en la que los pares análogos de dicha subbiblioteca comprenden una secuencia que codifica la región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina unida a una secuencia que codifica la región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina.

14. La subbiblioteca según la reivindicación 13, en la que los pares análogos de dicha subbiblioteca codifican inmunoglobulinas de longitud completa seleccionadas de las clases de inmunoglobulina humana IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 y IgM.

15. La biblioteca según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la pluralidad de recipientes son placas con varios pocillos.

16. La biblioteca según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dichos pares análogos de secuencias que codifican la región variable se obtienen mediante un procedimiento que comprende las etapas siguientes:

a) proporcionar una fracción celular que contiene linfocitos de un donante;

b) obtener una población de células únicas aisladas distribuyendo las células de dicha fracción celular individualmente en una pluralidad de recipientes, y c) amplificar y efectuar la unión de las secuencias que codifican la región variable contenidas en dicha población de células únicas aisladas i) amplificando en un procedimiento de amplificación molecular multiplex secuencias de nucleótidos de interés usando un molde derivad de una célula única aislada; y ii) efectuando la unión de las secuencias de nucleótidos de interés amplificadas.

17. La biblioteca de la reivindicación 16, en la que el procedimiento comprende enriquecer la fracción celular 5 que contiene linfocitos obtenida en la etapa (a) para una población de linfocitos particular.

18. La biblioteca de la reivindicación 17, en la que la fracción celular que contiene linfocitos está enriquecida por células del linaje de linfocitos B.

19. La biblioteca de la reivindicación 17 ó 18, en la que la fracción celular que contiene linfocitos o el linaje de linfocitos B están enriquecidos por células plasmáticas.

20. La biblioteca según cualquiera de las reivindicaciones 17-19, en la que las células de la fracción celular que contiene linfocitos, el linaje de linfocitos B o las células plasmáticas están enriquecidas por especifidad de antígeno.

21. Una población de células huésped que comprende una biblioteca según cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

22. La población de células huésped según la reivindicación 21, en la que las células son células de mamífero.