Un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 97% con respecto a la secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº:

Polipéptidos antigénicos de Neisseria meningitidis polinucleótidos y anticuerpos protectores correspondientes.

Campo de la invención

Esta invención se refiere a polinucleótidos (en la presente memoria descriptiva denominados "polinucleótido(s) BASB082"), polipéptidos codificados por ellos (referidos en la presente memoria descriptiva como "BASB082" o "polipéptido(s) BASB082"), materiales recombinantes y procedimientos para su producción. En otro aspecto, la invención se refiere a procedimientos para usar dichos polipéptidos y polinucleótidos, incluyendo vacunas contra infecciones bacterianas. En un aspecto más, la invención se refiere a ensayos de diagnóstico para detectar infección de ciertos patógenos.

Antecedentes de la invención

Neisseria meningitidis (meningococo) es una bacteria Gram-negativa aislada frecuentemente en el tracto respiratorio superior humano. Ocasionalmente causa enfermedades bacterianas invasivas como bacteriemia y meningitis. La incidencia de enfermedad meningocócica muestra diferencias geográficas anuales y estacionales (Schwartz, B., Moore. P.S., Broome, C.V.; Clin. Microbiol. Rev. 2 (Suplemento), S18-S24, 1989). La mayoría de las enfermedades en los países templados se deben a cepas del serogrupo B y varían en incidencia de 1-10/100.000/año en población total, alcanzando a veces valores superiores (Kaczmarski, E.B. (1997). Commun. Dis. Rep. Rev. 7:R55-9, 1995; Scholten, R.J.P.M., Bijlmer, H.A., Poolman, J.T. y col., Clin. Infect. Dis. 16: 237 - 246, 1993; Cruz, C., Pavez, G., Aguilar, E., y col. Epidemiol. Infect. 105: 119 - 126,1990).

Se encuentran epidemias dominadas por meningococos del serogrupo A, principalmente en África central, que alcanzan a veces niveles de hasta 1.000/100.000/año (Schwartz, B., Moore, P.S., Broome, C.V. Clin. Microbiol. Rev. 2 (Suplemento), S18-S24, 1989). Casi todos los casos en conjunto de enfermedad meningocócica se deben a meningococos de los serogrupos A, B, C, W-135 e Y y se dispone de una vacuna de polisacáridos A, C, W-135, Y tetravalente (Armand, J., Arminjon, F., Mynard, M.C., Lafaix, C., J. Biol. Stand. 10: 335 - 339; 1982).

Las vacunas de polisacáridos están siendo mejoradas actualmente por medio de conjugación química con proteínas portadoras (Lieberman, J.M., Chiu, S.S., Wong, V.K., y col. JAMA 275: 1499 - 1503, 1996).

No se dispone de vacuna del serogrupo B, ya que se encontró que el polisacárido capsular B es no inmunogénico, con la máxima probabilidad porque comparte semejanza estructural con los componentes del huésped (Wyle, F.A., Artenstein, M.S., Brandt, M.L, y col., J. Infect. Dis. 126: 514 - 522, 1972; Finne, J.M., Leinonen, M., Mäkelä, P.M. Lancet ii: 355 - 357, 1983).

Durante muchos años se han iniciado y desarrollado esfuerzos para desarrollar vacunas basadas en la membrana externa meningocócica (de Moraes. J.C., Perkins. B., Camargo, M.C. y col., Lancet 340:1074-1078, 1992; Bjune, G., Hoiby, E.A. Gronnesby, J.K. y col. 338:1093-1096, 1991). Dichas vacunas han demostrado ser eficaces del 57% al 85% en niños mayores (> 4 años) y adolescentes.

En estas vacunas están presentes muchos componentes de membrana externa bacteriana, como PorA, PorB, Rmp, Opc, Opa, FrpB, y la contribución de estos componentes a la protección observada sigue necesitando mayor definición. Se han definido otros componentes de membrana exterior bacteriana mediante el uso de anticuerpos animales o humanos que son potencialmente relevantes para la inducción de inmunidad protectora, como TbpB y NspA (Martin, D., Cadieux. N., Hamel. J., Brodeux, B.R., J. Exp. Med. 185:1173-1183, 1997; Lissolo, L., Maître-Wilmotte, C., Dumas, P. y col., Inf. Immun. 63:884-890, 1995). Los mecanismos de inmunidad protectora implicarán actividad bactericida mediada por anticuerpos y opsonofagocitosis.

Se ha usado un modelo animal de bacteriemia para combinar todos los mecanismos mediados por anticuerpos (Saukkonen, K., Leinonen, M., Abdillahi, H., Pootman, J.T. Vaccine 7:325-328, 1989). Se acepta generalmente que el último mecanismo bactericida mediado por componentes de complemento es crucial para la inmunidad contra la enfermedad meningocócica (Ross, S.C., Rosenthal, P.J., Berberic, H.M., Densen, P.J., Infect. Dis. 155: 1266 - 1275, 1987).

El documento W099/57280 describe algunas secuencias de aminoácidos y secuencias de nucleótidos correspondientes derivadas de Neisseria meningitidis.

La frecuencia de infecciones por Neisseria meningitidis ha crecido espectacularmente en las últimas décadas. Ello se ha atribuido a la emergencia de múltiples cepas resistentes a los antibióticos y a una creciente población de personas con sistemas inmunitarios debilitados. Ya no es infrecuente aislar cepas de Neisseria meningitidis resistentes a alguno o a todos los antibióticos estándar. Este fenómeno ha creado una necesidad médica no satisfecha y una demanda de nuevos agentes antimicrobianos, vacunas, procedimientos de detección selectiva de fármacos y pruebas de diagnóstico para este organismo.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a BASB082, en particular polipéptidos BASB082 y polinucleótidos BASB082, materiales recombinantes y procedimientos para su producción. En otro aspecto, la invención se refiere a procedimientos para usar dichos polipéptidos y polinucleótidos, incluyendo prevención y tratamiento de enfermedades microbianas, entre otros. En un aspecto más, la invención se refiere a ensayos de diagnóstico para detectar enfermedades asociadas con infecciones microbianas y dolencias asociadas con dichas infecciones, como ensayos para detectar expresión o actividad de polinucleótidos o polipéptidos BASB082.

Varios cambios y modificaciones dentro del espíritu y el ámbito de la invención desvelada serán fácilmente evidentes para los expertos en la materia a partir de la lectura de las siguientes descripciones y de la lectura de las otras partes de la presente descripción.

Descripción de la invención

La invención se refiere a polipéptidos y polinucleótidos BASB082 según se describe más adelante en mayor detalle. La invención se refiere especialmente a BASB082, que tienen las secuencias de aminoácidos y nucleótidos establecidas en ID SEC Nº: 1, 3, 5 y ID SEC Nº: 2, respectivamente. Se entiende que las secuencias enumeradas en el Listado de Secuencias más adelante como "ADN" representan una ilustración de una forma de realización de la invención, dado que los expertos en la materia reconocerán que dichas secuencias pueden emplearse con utilidad en polinucleótidos en general, incluyendo ribopolinucleótidos.

Polipéptidos

En un aspecto de la invención se proporcionan polipéptidos de Neisseria meningitidis referidos en la presente memoria descriptiva como "polipéptidos BASB082", así como variantes de los mismos útiles en términos biológicos, diagnósticos, profilácticos, clínicos o terapéuticos, y composiciones que comprenden los mismos.

La presente invención proporciona además:

(a) un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene identidad de al menos el 97% más preferentemente al menos del 97% al 99%, o identidad exacta, con respecto a la de ID SEC Nº: 2.

(b) un polipéptido codificado por un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de polinucleótidos que tiene una identidad de al menos el 97%, más preferentemente de al menos del 97% al 99%, o identidad exacta, con respecto a la ID SEC Nº:1 en toda la longitud de ID SEC Nº:1.

(c) un polipéptido codificado por un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido que tiene una identidad de al menos el 97%, más preferentemente de al menos del 97% al 99%, o identidad exacta, con respecto a la secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº: 2.

El polipéptido BASB082 proporcionado en ID SEC Nº: 2 es el polipéptido BASB082 de las cepas de Neisseria meningitidis ATCC13090.

La invención proporciona también un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 85% con respecto a la secuencia de aminoácidos ID SEC Nº: 2, siempre que dicho polipéptido no sea un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº: 588, 586, 596, 598, 600 ó 584 del documento WO99/57280 y como se describe en el documento US60/121.528.

La invención proporciona también un fragmento inmunogénico del polipéptido de la invención en el que el...

1. Un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 97% con respecto a la secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº: 2.

2. Un polipéptido aislado como se reivindica en la reivindicación 1, en el que la secuencia de aminoácidos tiene una identidad de al menos el 99% con respecto a la secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº: 2.

3. El polipéptido como se reivindica en la reivindicación 1 que comprende la secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº: 2.

4. Un polipéptido aislado de ID SEC Nº: 2.

5. Un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 85% con respecto a la secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº: 2, siempre que dicho polipéptido no sea un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº: 588, 586, 596, 598, 600 ó 584 del documento WO99/57280 y como se describe en el documento US60/121.528.

6. Un fragmento inmunogénico del polipéptido como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el fragmento inmunogénico comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 15 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº: 2 y que es capaz de suscitar una respuesta inmunitaria (si es necesario, cuando está acoplado a un vehículo) que reconoce el polipéptido de ID SEC Nº: 2 y en el que dicho fragmento inmunogénico carece de un dominio de anclaje C-terminal.

7. El fragmento inmunogénico de la reivindicación 6 en el que dicho fragmento inmunogénico además carece de una secuencia delantera N-terminal.

8. Un fragmento inmunogénico del polipéptido como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el fragmento inmunogénico comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 15 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº: 2 y que es capaz de suscitar una respuesta inmunitaria (si es necesario, cuando está acoplado a un vehículo) que reconoce el polipéptido de ID SEC Nº: 2, siempre que dicho fragmento no sea un fragmento que tiene la secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº: 588, 586, 596, 598, 600 ó 584 del documento WO99/57280 y como se describe en el documento US60/121.528 o un fragmento que tiene 7 o más aminoácidos de 588, 586, 596, 598, 600 ó 584 del documento WO99/57280 y como se describe en el documento US60/121.528.

9. Un polipéptido que comprende un polipéptido o un fragmento inmunogénico como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

10. Un polipéptido que comprende un fragmento inmunogénico se reivindica en la reivindicación 8 con la condición de que dicho polipéptido no sea un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº: 588, 586, 596, 598, 600 ó 584 del documento WO99/57280 y como se describe en el documento US60/121.528, o un o un fragmento que tiene 7 o más aminoácidos de 588, 586, 596, 598, 600 ó 584 del documento WO99/57280 y como se describe en el documento US60/121.528.

11. Un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido o fragmento inmunogénico como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

12. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene una identidad de al menos el 97% con respecto a la secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº: 2 en toda la longitud de ID SEC Nº: 2, o una secuencia de nucleótidos complementaria en toda su longitud a dicho polinucleótido aislado.

13. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos identidad del 97% con respecto a una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de ID SEC Nº: 2 en toda la región de codificación; o una secuencia de nucleótidos complementaria en toda su longitud a dicho polinucleótido aislado.

14. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene identidad de al menos el 97% con respecto a ID SEC Nº: 1, en toda la longitud de ID SEC Nº: 1; o una secuencia de nucleótidos complementaria en toda su longitud a dicho polinucleótido aislado.

15. El polinucleótido aislado según se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14 en el que la identidad es de al menos el 99% con respecto a ID SEC Nº: 1.

16. Un polinucleótido aislado según se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 15 que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de ID SEC Nº: 2.

17. Un polinucleótido aislado según se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 16 que comprende el polinucleótido de ID SEC Nº: 1.

18. Un polinucleótido aislado según se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 17 que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de ID SEC Nº: 2, obtenible por detección selectiva de una biblioteca apropiada en condiciones de hibridación estrictas con una sonda marcada que tiene la secuencia de ID SEC Nº: 1 o un fragmento de la misma.

19. Un vector de expresión que comprende un polinucleótido aislado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 18.

20. Un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 19 en el que el polinucleótido comprende una región hacia arriba recombinante que contiene un elemento regulador heterólogo.

21. Un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 20 en el que el elemento regulador heterólogo es un promotor fuerte.

22. Un microorganismo vivo recombinante que comprende un vector de expresión de una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21.

23. Una célula hospedadora que comprende el vector de expresión de una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21 o una fracción subcelular o una membrana de dicha célula hospedadora que expresa un polipéptido asilado recombinante o un fragmento inmunogénico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

24. Una célula hospedadora de Neisseria meningitidis que comprende un vector de expresión, en el que dicho vector de expresión comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene identidad de al menos el 85% con respecto a la secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº: 2, o un fragmento inmunogénico del mismo que es capaz de suscitar una respuesta inmunitaria (si es necesario, cuando está acoplado a un vehículo) que reconoce el polipéptido de ID SEC Nº: 2 o un polipéptido que comprende dicho fragmento inmunogénico; o una fracción subcelular o membrana de dicha célula hospedadora que expresa dicho polipéptido o fragmento inmunogénico.

25. Una célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 24 en la que dicha secuencia de nucleótidos tiene identidad de al menos el 85% con respecto a la de ID SEC Nº: 1.

26. Un procedimiento para producir un polipéptido recombinante o un fragmento inmunogénico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que comprende el cultivo de una célula hospedadora de la reivindicación 23 en condiciones suficientes para la producción de dicho polipéptido o fragmento inmunogénico y la recuperación del polipéptido del medio de cultivo.

27. Un procedimiento para producir un polipéptido recombinante que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene identidad de al menos el 85% con respecto a la secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº: 2, o un fragmento inmunogénico del mismo que es capaz de suscitar una respuesta inmunitaria (si es necesario, cuando está acoplado a un vehículo) que reconoce el polipéptido de ID SEC Nº: 2 o un polipéptido que comprende dicho fragmento inmunogénico, que comprende el cultivo de una célula hospedadora de la reivindicación 24 ó 25 en condiciones suficientes para la producción de dicho polipéptido o fragmento inmunogénico y la recuperación del polipéptido del medio de cultivo.

28. Un procedimiento para producir una vacuna, que comprende el procedimiento de la reivindicación 26 ó 27 y que además comprende la etapa de formular dicho polipéptido o fragmento inmunogénico con un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.

29. Un procedimiento para la expresión recombinante de un polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 18 que comprende la transformación de una célula hospedadora con un vector de expresión que comprende al menos uno de dichos polinucleótidos y el cultivo de dicha célula hospedadora en condiciones suficientes para la expresión de uno cualquiera de dichos polinucleótidos.

30. Un procedimiento para la expresión recombinante de un polinucleótido que tiene identidad de al menos el 85% con respecto a la de ID SEC Nº: 1, que comprende el cultivo de una célula hospedadora de la reivindicación 24 ó 25 en condiciones suficientes para la expresión de uno cualquiera de dichos polinucleótidos.

31. Una vesícula de la membrana exterior bacteriana que comprende un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 85% con respecto a la secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº: 2, o un fragmento inmunogénico del mismo que es capaz de suscitar una respuesta inmunitaria (si es necesario, cuando está acoplado a un vehículo) que reconoce el polipéptido de ID SEC Nº: 2, o un polipéptido que comprende dicho fragmento inmunogénico, obtenible a partir de una célula hospedadora que comprende un vector de expresión, comprendiendo el vector de expresión un polinucleótido que codifica dicho polipéptido o fragmento inmunogénico, y teniendo el polinucleótido una región cadena arriba modificada que contiene un elemento regulador heterólogo.

32. Una composición de vacuna que comprende una cantidad eficaz del polipéptido o del fragmento inmunogénico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, o la vesícula de la membrana exterior bacteriana de la reivindicación 31, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

33. Una composición de vacuna que comprende una cantidad eficaz del polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 18 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

34. La composición de vacuna según una cualquiera de las reivindicaciones 32 ó 33 en la que dicha composición comprende al menos un antígeno de Neisseria meningitidis.

35. Una composición de vacuna que comprende:

(i) Una cantidad eficaz de un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 85% con respecto a la secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº: 2, o un fragmento inmunogénico del mismo que es capaz de suscitar una respuesta inmunitaria (si es necesario, cuando está acoplado a un vehículo) que reconoce el polipéptido de ID SEC Nº: 2 o un polipéptido que comprende dicho fragmento inmunogénico;
(ii) Un vehículo farmacéuticamente aceptable; y
(iii) Un adyuvante seleccionado del grupo que está constituido por lípido A de monofosforilo 3-des-O-acilado, QS21, QS21 y colesterol, un oligonucleótido inmunomodulatorio y combinaciones de los mismos.

36. Una composición de vacuna que comprende:

(i) Una cantidad eficaz de un polinucleótido que tiene una identidad al menos el 85% con respecto a la de ID SEC Nº: 1;
(ii) Un vehículo farmacéuticamente aceptable; y
(iii) un adyuvante seleccionado del grupo que está constituido por lípido A de monofosforilo 3-des-O-acilado, QS21, QS21 y colesterol, un oligonucleótido inmunomodulatorio y combinaciones de los mismos.

37. Una vacuna de acuerdo con las reivindicaciones 35 ó 36 en la que dicho oligonucleótido inmunomodulatorio comprende CpG no metilado.

38. Una composición de vacuna de acuerdo con las reivindicaciones 35 ó 36 en la que el vehículo comprende una emulsión aceite en agua que comprende un aceite metabolizable.

39. Una composición de vacuna de acuerdo con la reivindicación 38 en la que el aceite metabolizable comprende escualeno, alfa-tocoferol y Tween 80.

40. Un procedimiento de diagnóstico de infección por Neisseria meningitidis que comprende la identificación de un polipéptido o un fragmento inmunogénico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o un anticuerpo generado contra el polipéptido como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, presente en una muestra biológica de un animal sospechoso de tener dicha infección.

41. Un procedimiento de purificación de un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene identidad de al menos el 85% con respecto a la secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº: 2, o un fragmento inmunogénico del mismo que es capaz de suscitar una respuesta inmunitaria (si es necesario, cuando está acoplado a un vehículo) que reconoce el polipéptido de ID SEC Nº: 2 o un polipéptido que comprende dicho fragmento inmunogénico, en el que dicho procedimiento se selecciona del grupo que está constituido por precipitación de sulfato de amonio, precipitación de etanol, extracción ácida, cromatografía de fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de hidroxilapatito y cromatografía de lecitina.

42. Un procedimiento para producir una composición de vacuna que comprende un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene identidad de al menos el 85% con respecto a la secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº: 2, o un fragmento inmunogénico del mismo que es capaz de suscitar una respuesta inmunitaria (si es necesario, cuando está acoplado a un vehículo) que reconoce el polipéptido de ID SEC Nº: 2 o un polipéptido que comprende dicho fragmento inmunogénico, en el que el procedimiento comprende el procedimiento de la reivindicación 41 y además comprende la etapa de formular dicho polipéptido o fragmento inmunogénico con un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.

43. Uso de una composición que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de un polipéptido o un fragmento inmunogénico según se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, o la vesícula de la membrana exterior bacteriana de la reivindicación 31 en la preparación de un medicamento para su uso en la generación de una respuesta inmunitaria en un animal.

44. Uso de una composición que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de un polipéptido o un fragmento inmunogénico según se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, o la vesícula de la membrana exterior bacteriana de la reivindicación 31, en la preparación de un medicamento para su uso en el tratamiento o prevención de enfermedad por Neisseria meningitidis.

45. Uso de una composición que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de un polinucleótido como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 18 en la preparación de un medicamento para su uso en la generación de una respuesta inmunitaria en un animal.

46. Uso de una composición que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de un polinucleótido como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 18 en la preparación de un medicamento para su uso en el tratamiento o prevención de enfermedad por Neisseria meningitidis.

47. Un polipéptido o un fragmento inmunogénico según se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, o la vesícula de la membrana exterior bacteriana de la reivindicación 31, para su uso en la generación de una respuesta inmunitaria en un animal.

48. Un polipéptido o un fragmento inmunogénico según se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, o la vesícula de la membrana exterior bacteriana de la reivindicación 31, para su uso en el tratamiento o prevención de enfermedad por Neisseria meningitidis.

49. Un polinucleótido según se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 18, para su uso en la generación de una respuesta inmunitaria en un animal.

50. Un polinucleótido según se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 18, para su uso en el tratamiento o prevención de enfermedad por Neisseria meningitidis.