Construcciones donantes lineales para integración dirigida.

Uso de una molécula de ácido nucleico donante lineal para la integración dirigida dependiente de homología de una secuencia de interés en una célula eucariota

, comprendiendo la molécula de ácido nucleico donante brazos de homología de entre 50 y 100 pares de bases y la secuencia de interés, en donde los brazos de homología flanquean la secuencia de interés.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2009/002292.

Solicitante: SANGAMO BIOSCIENCES, INC..

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: Point Richmond Tech. Center II 501 Canal Boulevard, Suite A100 Richmond, CA 94804 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: DEKELVER,RUSSELL, HOLMES,MICHAEL C, URNOV,FYODOR, GREGORY,PHILIP D.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/82 (para células vegetales)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/90 (Introducción estable de ADN extraño en el cromosoma)

PDF original: ES-2459880_T3.pdf

 

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Fragmento de la descripción:

Construcciones donantes lineales para integración dirigida

Campo técnico

La presente descripción pertenece al campo de ingeniería genómica, particularmente construcciones donantes lineales para integración dirigida en el genoma de una célula.

Antecedentes Un área principal de interés en biología genómica, especialmente a la luz de la determinación de las secuencias completas de nucleótidos de varios genomas, es la integración dirigida en secuencias genómicas. Se han hecho intentos por alterar secuencias genómicas en células cultivadas aprovechando el fenómeno natural de la recombinación homóloga. Véase, por ejemplo, Capecchi (1989) Science 244:1288-1292; patentes de Estados Unidos Nº 6.528.313 y 6.528.314.

Además, se han descrito diversos métodos y composiciones para la escisión dirigida de ADN genómico. Dichos eventos de escisión dirigida pueden usarse, por ejemplo, para inducir mutagénesis dirigida, inducir deleciones dirigidas de secuencias de ADN celular, y facilitar la recombinación dirigida e integración dirigida en un locus cromosómico predeterminado. Véanse, por ejemplo, las publicaciones de patente de Estados Unidos 20030232410; 20050208489; 20050026157; 20050064474; y 20060188987, y la publicación internacional WO 2007/014275. Por ejemplo, se ha demostrado la integración dirigida usando nucleasas de dedos de zinc con ADN circulares (plasmídicos) que tienen largos (~750 pares de bases) brazos de homología. Véase, Moehle et al. (2007) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 104 (9) :3055-3060.

Sin embargo, sigue existiendo la necesidad de composiciones adicionales que comprendan polinucleótidos exógenos lineales más cortos que puedan resistir opcionalmente la degradación por exonucleasa y el uso de estas composiciones en métodos para integración dirigida.

Compendio La presente descripción proporciona ácidos nucleicos exógenos (donantes) lineales, composiciones que comprendan estos ácidos nucleicos y métodos para preparar y usar estas moléculas donantes lineales. En líneas generales, las moléculas donantes descritas en la presente memoria tienen dos brazos de homología de entre 50 y 100 pares de bases flanqueando una secuencia de interés.

Las secuencias donantes pueden integrarse de un modo dirigido en el genoma de una célula, por ejemplo usando nucleasas de dedos de zinc (ZFN) y/o meganucleasas. La integración de las secuencias exógenas de ácido nucleico en el genoma se facilita mediante escisión bicatenaria dirigida del genoma (cromosoma) en la región de interés. La escisión se dirige preferiblemente a la región de interés a través del uso de proteínas de fusión que comprenden un dominio de unión de dedos de zinc, que se diseña para que se una a una secuencia dentro de la región de interés, y un dominio de escisión o un semi-dominio de escisión. Dicha escisión estimula la integración de las secuencias polinucleotídicas exógenas en o cerca del sitio de escisión.

En un aspecto, en la presente memoria se describe una molécula de ácido nucleico lineal (molécula donante) que comprende brazos de homología de 50-100 pares de bases flanqueando una secuencia de interés y se proporciona. En ciertas realizaciones, la molécula donante lineal persiste de forma estable en la célula en la que se ha introducido. En otras realizaciones, la molécula donante lineal se modifica para resistir la escisión exonucleolítica, por ejemplo colocando uno o más enlaces fosfodiéster fosforotioato entre uno o más pares de bases en los extremos de la molécula donante.

La secuencia de interés de la molécula donante puede comprender una o más secuencias que codifican un polipéptido funcional (por ejemplo, un ADNc) , con o sin un promotor. En ciertas realizaciones, la secuencia de ácido nucleico comprende una secuencia sin promotor que codifica un anticuerpo, un antígeno, una enzima, un factor de crecimiento, un receptor (de superficie celular o nuclear) , una hormona, una linfoquina, una citoquina, un indicador, fragmentos funcionales de cualquiera de los anteriores y combinaciones de los anteriores. La expresión de la secuencia integrada entonces se asegura por transcripción dirigida por un promotor endógeno u otro elemento de control en la región de interés. En otras realizaciones, se integra un casete en "tándem" en el sitio seleccionado de este modo, comprendiendo el primer componente del casete una secuencia sin promotor como se ha descrito anteriormente, seguida por una secuencia de terminación de la transcripción, y una segunda secuencia, que codifica un casete de expresión autónomo. Pueden incluirse secuencias adicionales (secuencias codificantes o no codificantes) en la molécula donante entre los brazos de homología, incluyendo, pero sin limitarse a, secuencias que codifican un péptido 2A, sitio SA, IRES, etc.

Las moléculas donantes de la descripción pueden insertarse en una localización específica en un genoma después de la escisión del genoma, por ejemplo usando una o más moléculas de fusión que comprenden un dominio de unión a ADN dirigido a la localización específica en el genoma y un dominio de escisión (por ejemplo, nucleasa de

dedos de zinc (ZFN) o meganucleasa de origen natural o no natural a un locus particular) . Por tanto, en otro aspecto, en la presente memoria se proporciona un método para integrar una secuencia exógena como se describe en la presente memoria en una región de interés en el genoma de una célula., comprendiendo el método: (a) expresar una proteína de fusión en la célula, comprendiendo la proteína de fusión un dominio de unión a ADN (por ejemplo, dominio de unión de dedos de zinc) y un dominio de escisión o semi-dominio de escisión, en que el dominio de unión a ADN (por ejemplo, dominio de unión de dedos de zinc) se ha diseñado para que se una a un sitio diana en la región de interés en el genoma de la célula; y (b) poner en contacto la célula con un polinucleótido donante como se describe en la presente memoria, en que la unión de la proteína de fusión al sitio diana escinde el genoma de la célula en la región de interés, provocando de este modo la integración de la secuencia exógena en el genoma de la célula dentro de la región de interés.

En ciertas realizaciones, los métodos comprenden las etapas de (a) expresar una primera proteína de fusión en la célula, comprendiendo la primera proteína de fusión un primer dominio de unión de dedos de zinc y un primer semidominio de escisión, en que el dominio de unión de dedos de zinc se ha diseñado para que se una a un primer sitio diana en la región de interés en el genoma de la célula; (b) expresar una segunda proteína de fusión en la célula, comprendiendo la segunda proteína de fusión un segundo dominio de unión de dedos de zinc y un segundo semidominio de escisión, en que el segundo dominio de unión de dedos de zinc se une a un segundo sitio diana en la región de interés en el genoma de la célula, en que el segundo sitio diana es diferente del primer sitio diana; y (c) poner en contacto la célula con una molécula donante exógena como se describe en la presente memoria, en que la unión de la primera proteína de fusión al primer sitio diana, y la unión de la segunda proteína de fusión al segundo sitio diana, posiciona los semi-dominios de escisión de tal modo que el genoma de la célula se escinde en la región de interés, provocando de este modo la integración de la molécula donante exógena en el genoma de la célula dentro de la región de interés.

En cualquiera de los métodos descritos en la presente memoria, el polinucleótido donante comprende una secuencia que codifica un polipéptido funcional, cuya secuencia se inserta en el genoma de la célula.

Además, en cualquiera de los métodos... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Uso de una molécula de ácido nucleico donante lineal para la integración dirigida dependiente de homología de una secuencia de interés en una célula eucariota, comprendiendo la molécula de ácido nucleico donante brazos de homología de entre 50 y 100 pares de bases y la secuencia de interés, en donde los brazos de homología flanquean la secuencia de interés.

2. El uso de la reivindicación 1, en donde uno o más de los pares de bases de los brazos de homología están unidos con un enlace fosfodiéster fosforotioato.

3. El uso de la reivindicación 2, en donde los enlaces fosfodiéster fosforotioato están posicionados en el primero y, opcionalmente, el segundo enlaces de los extremos 5' y 3' del ácido nucleico donante.

4. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el ácido nucleico donante lineal comprende adicionalmente, entre los brazos de homología, una secuencia seleccionada del grupo que consiste en una secuencia que codifica un péptido 2A, una secuencia que comprende un sitio SA, y una secuencia que comprende una secuencia IRES.

5. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la secuencia de interés no codifica un polipéptido.

6. El uso de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la secuencia de interés codifica un polipéptido.

7. El uso de la reivindicación 6, en donde el ácido nucleico donante lineal comprende adicionalmente una secuencia promotora unida de forma funcional a la secuencia de interés.

8. El uso según la reivindicación 6 o 7, en donde el polipéptido se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo, un antígeno, una enzima, un factor de crecimiento, un receptor de superficie celular, un receptor nuclear, una hormona, una linfoquina, una citoquina, un gen receptor, un marcador de selección, un factor secretado, una marca epitópica y fragmentos funcionales de los mismos y combinaciones de los mismos.

9. El uso según la reivindicación 5, en donde el ácido nucleico no codificante se selecciona del grupo que consiste en un ARNmi, y SH-ARN, o ARNip.

10. Un método in-vitro para la integración dirigida dependiente de homología de una secuencia de interés en una región de interés en el genoma de una célula eucariota, comprendiendo el método las etapas de:

(a) expresar una proteína de fusión en la célula, comprendiendo la proteína de fusión un dominio de unión a ADN o un semi-dominio de escisión, en donde el dominio de unión a ADN se ha diseñado para que se una a un sitio diana en la región de interés;

(b) poner en contacto la célula con un polinucleótido donante de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde la unión de la proteína de fusión al sitio diana escinde el genoma de la célula en la región de interés, provocando de este modo la integración dirigida dependiente de homología de la secuencia de interés en el genoma de la célula.

11. Un método in-vitro para la integración dirigida dependiente de homología de una secuencia de interés en una célula eucariota, comprendiendo el método:

(a) expresar una primera proteína de fusión en la célula, comprendiendo la primera proteína de fusión un primer dominio de unión a ADN y un primer semi-dominio de escisión, en donde el primer dominio de unión a ADN se ha diseñado para unirse a un primer sitio diana en una región de interés en el genoma de la célula;

(b) expresar una segunda proteína de fusión en la célula, comprendiendo la segunda proteína de fusión un segundo dominio de ADN y un segundo semi-dominio de escisión, en donde el segundo dominio de unión de dedos de zinc se une a un segundo sitio diana en la región de interés en el genoma de la célula, en donde el segundo sitio diana es diferente del primer sitio diana; y

(c) poner en contacto la célula con un polinucleótido que comprende un ácido nucleico donante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde la unión de la primera proteína de fusión al primer sitio diana, y la unión de la segunda proteína de fusión al segundo sitio diana, posiciona los semi-dominios de escisión de tal modo que el genoma de la célula se escinde en la región de interés, provocando de este modo la integración dependiente de homología del ácido nucleico donante en el genoma de la célula.

12. El método in-vitro de la reivindicación 10 o reivindicación 11, en donde al menos un dominio de unión a ADN es un dominio de unión de dedos de zinc o un dominio de unión a ADN de meganucleasa y/o en donde el dominio de escisión es un dominio de escisión de meganucleasa de tipo silvestre o de origen no natural o un dominio de escisión de endonucleasa de restricción Tipo IIS de tipo silvestre o de origen no natural tal como un dominio de escisión FokI o StsI.

13. El método in-vitro según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 11, en donde la célula es una célula de mamífero tal como una célula humana o una célula vegetal.

14. El método in-vitro según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, en donde la célula está detenida en la fase G2 del ciclo celular.