Cepa de Trichoderma atroviride, método de aislamiento de dicha cepa, método de obtención de un producto basado en dicha cepa y uso de dicha cepa.

Cepa de Trichoderma atroviride caracterizada porque se trata de la cepa de Trichoderma atroviride AGR2 depositada ante la Colección Nacional de Cultivo de Microorganismos

(CNCM) del Instituto Pasteur con el número I-2738

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E08008754.

Solicitante: AGROLOR CENTRE D'AFFAIRES "LE CAHN".

Nacionalidad solicitante: Francia.

Dirección: 17 RUE LAURENT BONNEVAY 54100 NANCY FRANCIA.

Inventor/es: DHUICQ,LAURENT.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > AGRICULTURA; SILVICULTURA; CRIA; CAZA; CAPTURA; PESCA > CONSERVACION DE CUERPOS HUMANOS O ANIMALES O DE VEGETALES... > A01N63/00 (Biocidas, productos que repelen o atraen a los animales perjudiciales, o reguladores del crecimiento de los vegetales, que contienen microorganismos, virus, hongos microscópicos, animales, p. ej. nematodos, o sustancias producidas por, u obtenidas a partir de microorganismos, virus, hongos microscópicos o animales, p.ej. encimas o productos de fermentación (que contienen compuestos de constitución determinada A01N 27/00 - A01N 59/00))
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Microorganismos, p.ej. protozoos; Composiciones que... > C12N1/14 (Microorganismos fúngicos (cultivo de setas A01G 1/04; como novedades vegetales A01H 15/00 ); Sus medios de cultivo)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > SISTEMA DE INDEXACION ASOCIADO A LAS SUBCLASES C12C... > Microorganismos > C12R1/885 (Trichoderma)

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Fragmento de la descripción:

Cepa de Trichoderma atroviride, método de aislamiento de dicha cepa, método de obtención de un producto basado en dicha cepa y uso de dicha cepa La presente invención está relacionada con la utilización de la especie Trichoderma atroviride contra las enfermedades de las plantas, y más particularmente una nueva cepa de Trichoderma atroviride, denominada AGR2, y su utilización como producto fitosanitario destinado a la protección de los cultivos contra las enfermedades criptogámicas, específicamente para la vid.

La nueva cepa de Trichoderma atroviride AGR2 fue aislada de un suelo francés cultivado y presentada ante la Colección Nacional de Cultivo de Microorganismos (CNCM) del Instituto Pasteur con el número I-2738, el 19 de octubre de 2001.

Los hongos del género Trichoderma se usan generalmente como productos de base para innumerables preparaciones fitosanitarias, destinadas al tratamiento de enfermedades criptogámicas.

De esta forma, la patente FR 2 841 436 describe una composición de microorganismos utilizada para combatir determinadas enfermedades criptogámicas que afectan la vid, como son los casos de la esca o la eutipiosis. Esta composición está constituida por una mezcla de una bacteria, una levadura y un hongo, específicamente una cepa de Trichoderma.

La patente FR 2 8694 832 describe una cepa particular de Trichoderma harzanium que constituye la base de un producto fitosanitario destinado a la lucha biológica de enfermedades criptogámicas de la madera de la vid, como la esca o el eutipiosis.

El documento Elmer P A G ET AL. : « Biosuppression of Botr y tis cinerea in grapes » PLANT PATHOLOGY (OXFORD) , vol. 55, no. 2, abril 2006, páginas 155-177, describe la utilización de Trichoderma atroviride LC52 en la lucha contra las enfermedades de las plantas, en particular contra Botr y tis cinerea.

El documento JP 11 225745 describe la utilización de Trichoderma atroviride SKT-1, SKT-2 y SKT-3 en la lucha contra las enfermedades de las plantas.

El documento EP1 279 335 describe la utilización de la especie Trichoderma atroviride en la lucha contra las enfermedades de las plantas, como el producto fitosanitario por pulverización, como el producto fitosanitario constituido por este microorganismo solamente y como el producto destinado a la simulación en las raíces, la germinación y el crecimiento de las plantas.

El documento Schubert Mark « in vitro und ad planta Studien zum Einsatz von Trichoderma-Arten für die Biologische Kontrolle Holz abbauender Pilze an Bäumen" 2006, Freiburg im Breisgau Extrait de l’Internet: URL:http://webdoc.sub.gwdg.de/ebook/dissts/Freiburg/Schubert2007.pdf divulga un estudio sobre el empleo de diversas cepas de Trichoderma para control biológico de hongos linofagos en los árboles.

La presente invención propone la especie Trichoderma atroviride así como una nueva cepa de Trichoderma atroviride y su utilización, sola o en un producto fitosanitario, para la protección de los cultivos contra las enfermedades criptogámicas, específicamente para la vid contra las enfermedades de la madera:

-la Esca, debido a un complejo fúngico, compuesto de dos categorías de hongos, los hongos pioneros (Eutypa lata, Phaemoniella chlamydospora, Phaeoacremonium aleophilum) y los hongos secundarios (Fomitiporia punctata, Stereum hirsutum) ,

-Brazo Negro Muerto, causado por Botr y osphaeria dothidea, B. stevensii, Botr y ophaeria spp,

-Eutipiosis causado por un solo hongo, Eutypa tata, que penetra en la madera a partir de las heridas ocasionadas por cortes, causando un debilitamiento de la madera,

-y Excoriosis debido a Phomopsis viticola.

Según la invención la especie Trichoderma atroviride en general así como la nueva cepa AGR2 en particular permiten igualmente luchar contra las enfermedades criptogámicas para todos los cultivos, específicamente:

-el Moho gris debido a Botr y tis cinérea, B. aili,

-la Esclerotinia debido a S. sclerotiorum, S. minor, S. cepivorum,

-la Fusariosa debido a Microdocchium nivale, F. oxysporum,

-la Armillaira debido a Armillaria mella.

Para este fin, la presente invención tiene como objeto la utilización de la especie Trichoderma atroviride en la lucha contra las enfermedades de las plantas.

La misma se relaciona igualmente con una cepa de Trichoderma atroviride caracterizada porque se trata de la cepa de Trichoderma atroviride AGR2 presentada ante en la Colección Nacional de Cultivo de Microorganismos (CNCM) del Instituto Pasteur con el número I-2738.

La cepa de Trichoderma atroviride AGR2 según la invención fue identificada por medio de diversos métodos. La observación microscópica de la morfología, de la medición de los elementos conidiógenos y de las conidias globulosas no ornamentales, así como un olor característico arrojó como conclusión un hongo de la especie Trichoderma atroviride.

La identificación de la cepa fue más depurada por un análisis molecular basado en la secuencia de la región ITS1-ITS2

des ARNr (ácido ribonucleico ribosomal) 18S y 25S. Una comparación de las homologías de dichas regiones con la secuencia de la cepa de referencia de la especie permite identificar la cepa como un hongo de la especie Trichoderma atroviride.

Las técnicas moleculares, en particular la secuenciación del gen EF1a, permiten identificar sin ambigüedad la especie como un Trichoderma atroviride seguido de una comparación de la secuencia del gen con el de la especie de referencia. Por otra parte, la prueba de detección denominada « test 11 » resulta positiva, confirmando así la pertenencia de la cepa a la especie Trichoderma atroviride.

Como conclusión, dicha cepa de hongo se ubica así en la taxonomía de los microorganismos : Eucar y ota, Fungi,

Ascomycota, Pezizomycotina, Sordariomycetes, Hypocreomycetidae, Hypocreales, Hypocreaceae, Hypocrea, Trichoderma atroviride.

El aislamiento del género Trichoderma puede realizarse a partir de una muestra de tierra o a partir de materias orgánicas. El suelo será de preferencia húmedo, cultivado o de jardín de manera que posea una concentración importante de Trichoderma.

Después de tose marlas, las muestras se secan a temperatura fresca (20-25°C) , trituran y homogeneízan y después se conservan en sacos de plástico en un lugar fresco (4-5°C) en espera de proceder al aislamiento. Aunque pueden ser mantenidas por varios meses, es preferible, sin embargo, tratarlas lo más rápidamente posible.

El aislamiento de la población de Trichoderma, en particular la Trichoderma atroviride AGR2, tomada de muestra se realizará en medios específicos seleccionados:

- el medio de Davet compuesto por:

o Ca (NO3) 2: 1g,

o CaCl2, 2H2O : 1 g,

o KNO3: 250 mg,

o MgSO4, 7H2O : 250 mg,

o KH2PO4: 125 mg,

o sacarosa : 2g,

o ácido cítrico : 50 mg,

o gel de agar: 25 g,

o agua destilada : 1000 ml.

Después de pasarlo por la autoclave, el pH es ajustado a 4, 5 con HCl 1 N antes de añadir al medio tibio sulfato de estreptomicina (30 mg) , vinclozolina (2, 5 mg) , y alcohol alílico (0, 5 ml) .

- el medio TSM de Elad y otros que comprende:

o MgSO4, 7H2O : 200 mg,

o KH2PO4: 900 mg,

o KCI : 150 mg,

o NH4NO3: 1 g,

o glucosa: 3g,

o cloranfenicol: 250 mg,

o fenaminosulfo : 300 mg,

o quintozeno : 200 mg,

o rosa bengala : 150 mg,

o gel de agar : 20 g,

o agua destilada: 1000 ml.

- el medio TME de Papavizas compuesto por:

o glucosa : 1g,

o gel de agar: 20 g,

o agua destilada : 800 ml.

La mezcla se coloca después en el autoclave. Se le añaden 200 ml de V-8, el pH debe estar comprendido entre 3, 8 y 4.... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Cepa de Trichoderma atroviride caracterizada porque se trata de la cepa de Trichoderma atroviride AGR2

depositada ante la Colección Nacional de Cultivo de Microorganismos (CNCM) del Instituto Pasteur con el 5 número I-2738.

2. Método para aislar la cepa de Trichoderma atroviride AGR2 según la reivindicación 1, caracterizado porque comprende las etapas siguientes:

a. recoger la cepa de Trichoderma atroviride AGR2 en una muestra de tierra,

b. espolvorear y dispersar la muestra recogida en la etapa anterior en una placa de Petri .

3. 40°C conteniendo un medio de aislamiento,

c. agitar suavemente hasta la solidificación del medio,

d. incubar por varios días, 15 e. examinan, enumerar y aislar las colonias de Trichoderma atroviride AGR2.

3. Método para aislar la cepa de Trichoderma atroviride AGR2 según la reivindicación 1, caracterizado porque comprende las etapas siguientes:

a. recoger una muestra de tierra compuesta de materias orgánicas,

b. suspender dicha muestra (10g) en 90 ml de agua estéril con una gota de Tween,

c. agitar durante 30 minutos,

d. tomar de 10 ml de dicha solución y luego sucesivas diluciones hasta 10-6,

e. adicionar 10 ml de cada solución en 90 ml de medio de aislamiento, mantenido en sobrefusión en baño 25 de María .

3. 40°C,

f. homogeneizar y repartir en placas de Petri,

g. incubar durante 3 a 5 días,

h. examinan, enumerar y aislar las colonias de Trichoderma atroviride AGR2.

4. Método de aislamiento según una de las reivindicaciones 2 ó 3, caracterizado porque comprende las etapas siguientes:

a. trasplantar las colonias aisladas en medio PDA, y exponer a la luz durante 4 a 5 días,

b. recoger las esporas de color verde, 35 c. suspender las esporas en el agua estéril,

d. seleccionar la colonia más vigorosa,

e. trasplantar a una placa de Petri,

f. prueba de confrontación con una cepa de Botr y tis cinerea.

5. Método de aislamiento según una de las reivindicaciones 2 ó 3, caracterizado porque el medio de aislamiento es el medio de Davet, constituido por:

-Ca (NO3) 2: 1g,

-CaCl2, 2H2O: 1g.

45. KNO3: 250 mg,

- MgSO4, 7H2O: 250 mg,

-KH2PO4: 125 mg,

- sacarosa: 2g,

- ácido cítrico: 50 mg,

- gel de agar: 25 g,

- agua destilada: 1000 ml; el medio se coloca posteriormente en el autoclave, con ajuste del pH a 4, 5 con HCl 1 N; y luego añadir al medio tibio de sulfato de estreptomicina (30 mg) , vinclozolina (2, 5 mg) , y alcohol alílico (0, 5 ml) .

6. Método de aislamiento según una de las reivindicaciones 2 ó 3, caracterizada porque el medio de aislamiento es el medio TSM de Elad y otros que comprende:

- Mg SO4, 7H2O: 200 mg,

-KH2PO4: 900 mg,

- KCl : 150 mg,

-NH4NO3: 1g,

-glucosa: 3g,

- cloranfenicol: 250 mg,

- fenaminosulf : 300 mg.

65. quintozeno : 200 mg,

- rosa bengala : 150 mg,

- gel de agar: 20 g,

- agua destilada 1000 ml el medio se coloca después en el autoclave, y se le añaden 200 ml de V-8, el pH debe estar comprendido entre 3, 8 y 4 ; cuando está aún tibio, al medio se le añade sulfato de neomicina (100 mg) , bacitracina (100 mg) , penicilina G (100 mg) , cloroneb (100 mg) , nistatina (20 mg) , clorotetraciclina HCL (25 mg) , propionato de sodio (500 mg) .

7. Método de aislamiento según una de las reivindicaciones 2 ó 3, caracterizado porque el medio de aislamiento es el medio de aislamiento TME de Papavizas constituido por :

- glucosa : 1 g,

- gel de agar: 20 g,

- agua destilada: 800 ml, que se coloca posteriormente en el autoclave, luego se le añaden 200 ml de V-8, el pH debe estar comprendido entre 3, 8 y 4 ; cuando está aún tibio, se le adiciona sulfato de neomicina (100 mg) , bacitracina (100 mg) , penicilina G (100 mg) , cloroneb (100 mg) , nistatina (20 mg) , clorotetraciclina HCL (25 mg) , y propionato de sodio (500 mg) .

8. Método de obtención de un producto a base de Trichoderma atroviride AGR2 obtenido según el método de una de las reivindicaciones 2 a 7, caracterizado porque consiste en diferentes etapas :

a. producir la cepa de Trichoderma atroviride AGR2 realizada en placas de Petri conteniendo un medio de cultivo Sabouraud o malta-agar, que contiene cloranfenicol,

b. aislar las cepas de Trichoderma atroviride AGR2, presentándose en forma de esporas,

c. inocular la cepa del hongo en pulpas de remolacha, papa, hojuelas de avena, de cebada o de maíz, de malta-agar o PDA estériles,

d. extruir el conjunto del sustrato, lo que permite obtener una concentración elevada de esporas,

e. adicionar cloruro de calcio.

f. incubar en cámara no estéril durante 4 a 6 días,

g. secar y micronizar en forma de polvo.

9. Utilización de la cepa de Trichoderma atroviride AGR2 según la reivindicación 1 u obtenida según el método de una de las reivindicaciones 2 a 8 en la lucha contra las enfermedades de las plantas.

10. Utilización de la cepa de Trichoderma atroviride AGR2 según la reivindicación 1 u obtenida según el método de una de las reivindicaciones 2 a 8, como producto fitosanitario por pulverización, o recubrimiento, o por embarre de las raíces.

11. Utilización de la cepa de Trichoderma atroviride AGR2 según la reivindicación 1 u obtenida según el método de una de las reivindicaciones 2 a 8, como el producto fitosanitario constituido por este sólo microorganismo.

12. Utilización de la cepa de Trichoderma atroviride AGR2 según la reivindicación 1 u obtenida según el método de una de las reivindicaciones 2 a 8, como producto fitosanitario en asociación con otros fungicidas químicos.

13. Utilización de la cepa de Trichoderma atroviride AGR2 según la reivindicación 1 u obtenida según el método de una de las reivindicaciones 2 a 8, como medio de lucha contra la esca, la eutipiosis, el brazo negro muerto, la excoriosis y la esclerotinia.

14. Utilización de la cepa de Trichoderma atroviride AGR2 según la reivindicación 1 u obtenida según el método de una de las reivindicaciones 2 a 8, como producto fitosanitario que actúa contra los hongos patógenos como Eutypa lata, Phaeomoniella chlamydospora, Phaeomoniella aleophilum, Fomitiporia punctata, Stereum hirsutum, Botr y osphaeria dothidea y stevensii, Phomopsis viticola, Botr y tis cinerea, Sclerotinia minor, sclerotiorum et cepivorum, Microdocchium nivale, Armillaria mella, Phomopsis hélianthi.

15. Utilización de la cepa de Trichoderma atroviride AGR2 según la reivindicación 1 u obtenida según el método de una de las reivindicaciones 2 a 8, como producto destinado a la estimulación de las raíces, la germinación y el crecimiento de las plantas, en particular las de lechugas.

16. Utilización de la cepa de Trichoderma atroviride AGR2 según la reivindicación 1 u obtenida según el método de una de las reivindicaciones 2 a 8, como elemento colonizador de la madera en los primeros centímetros.