Bacteria pasteurelácea atenuada que tiene una mutación en un gen de virulencia.

Una bacteria atenuada de Pasteurella multocida, que comprende una mutación en un gen representado por una secuencia polinucleotídica que codifica un polipéptido fhaC

(i) en la que la secuencia polinucleotídica hibrida con el complemento de la SEC ID N.O: 19 en condiciones restrictivas, comprendiendo tales condiciones un lavado final en tampón que comprende SSC 2X/SDS al 0,1 %, a 35°C hasta 45°C, o

(ii) en la que el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos al menos idéntica en un 80 % a la SEC ID NO: 20,

en la que la atenuación de la bacteria está causada por dicha mutación.

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E10181686.

Solicitante: Zoetis P&U LLC.

Inventor/es: LOWERY, DAVID E., KENNEDY, MICHAEL, J., FULLER,Troy,E.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO... > Preparaciones medicinales que contienen antígenos... > A61K39/02 (Antígenos bacterianos)
  • SECCION G — FISICA > METROLOGIA; ENSAYOS > INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION... > Investigación o análisis de materiales por métodos... > G01N33/569 (para microorganismos, p. ej. protozoarios, bacterias, virus)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Células no diferenciadas humanas, animales o vegetales,... > C12N5/10 (Células modificadas por introducción de material genético extraño, p. ej. células transformadas por virus)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/09 (Tecnología del ADN recombinante)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/31 (Genes que codifican proteínas microbianas, p. ej. enterotoxinas)
  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO... > Preparaciones medicinales que contienen antígenos... > A61K39/395 (Anticuerpos (aglutininas A61K 38/36 ); Inmunoglobulinas; Inmunosuero, p. ej. suero antilinfocitario)
  • SECCION G — FISICA > METROLOGIA; ENSAYOS > INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION... > Investigación o análisis de materiales por métodos... > G01N33/53 (Ensayos inmunológicos; Ensayos en los que interviene la formación de uniones bioespecíficas; Materiales a este efecto)
  • SECCION G — FISICA > METROLOGIA; ENSAYOS > INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION... > Investigación o análisis de materiales por métodos... > G01N33/50 (Análisis químico de material biológico, p. ej. de sangre, de orina; Investigación o análisis por métodos en los que interviene la formación de uniones bioespecíficas con grupos coordinadores; Investigación o análisis inmunológico (procedimientos de medida, de investigación o análisis diferentes de los procedimientos inmunológicos en los que intervienen enzimas o microorganismos, composiciones o papeles reactivos a este efecto; procedimientos para preparar estas composiciones, procedimientos de control sensibles a las condiciones del medio en los procedimientos microbiológicos o enzimáticos C12Q))
  • SECCION G — FISICA > METROLOGIA; ENSAYOS > INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION... > Investigación o análisis de materiales por métodos... > G01N33/577 (en los que interviene anticuerpos monoclonados)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN... > Preparación de péptidos o de proteínas (proteína... > C12P21/08 (Anticuerpos monoclonales)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/63 (Introducción de material genético extraño utilizando vectores; Vectores; Utilización de huéspedes para ello; Regulación de la expresión)
  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO... > Preparaciones medicinales que contienen sustancias... > A61K35/74 (Bacterias (uso terapéutico de una proteína de la bacteria A61K 38/00))
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas... > Inmunoglobulinas, p. ej. anticuerpos mono o policlonales > C07K16/12 (contra materiales bacterianos)
  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > ACTIVIDAD TERAPEUTICA ESPECIFICA DE COMPUESTOS QUIMICOS... > Antiinfecciosos, es decir antibióticos, antisépticos,... > A61P31/04 (Agentes antibacterianos)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Microorganismos, p.ej. protozoos; Composiciones que... > C12N1/19 (modificados por la introducción de material genético extraño)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN... > Preparación de péptidos o de proteínas (proteína... > C12P21/02 (que tienen una secuencia conocida de varios aminoácidos, p. ej. glutation)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Microorganismos, p.ej. protozoos; Composiciones que... > C12N1/21 (modificados por la introducción de material genético extraño)
  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO... > Preparaciones medicinales que contienen antígenos... > A61K39/102 (Pasteurella; Haemophilus)
  • SECCION G — FISICA > METROLOGIA; ENSAYOS > INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION... > Investigación o análisis de materiales por métodos... > G01N33/15 (preparaciones medicinales)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas... > Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas;... > C07K14/285 (de Pasteurellaceae (F), p. ej. Haemophilus influenza)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/01 (Preparación de mutantes sin introducción de material genético extraño; Procedimientos de cribado para ello)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Microorganismos, p.ej. protozoos; Composiciones que... > C12N1/15 (modificados por la introducción de material genético extraño)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS... > Procesos de medida, investigación o análisis en... > C12Q1/18 (Investigación o análisis de la actividad antimicrobiana de un material)

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Fragmento de la descripción:

Bacteria pasteurelácea atenuada que tiene una mutación en un gen de virulencia Campo de la invención

La presente invención se refiere de forma general a la identificación de genes responsables de la virulencia de las bacterias Pasteurella multocida y Actinobacillus pleuropneumoniae, permitiendo por lo tanto la producción de nuevas cepas mutantes atenuadas útiles en vacunas y la identificación de agentes antibacterianos nuevos que tiene como objetivo los genes de virulencia y sus productos.

Antecedentes de la invención

La familia de las pasteureláceas abarca varios patógenos significativos que infectan una amplia diversidad de animales. Además de P. multocida, miembros destacados de la familia incluyen Pasteurella haemolytica, Actinobacillus pleuropneumoniae y Haemophilus somnus. P. multocida es un cocobacilo gram-negativo, carente de motilidad que se encuentra en la flora normal de muchos animales salvajes y domésticos y se sabe que es la causa de enfermedad en numerosas especies animales en todo el mundo [Biberstein, In M. Kilian, W. Frederickson y E. L. Biberstein (ed.), Haemophilus, Pasteurella und Actinobacillus. Academic Press. Londres, páginas 61-73 (1981)]. Las manifestaciones morbosas tras la infección incluyen septicemias, bronconeumonfas, rinitis e infecciones de heridas [revisado en Shewen y cois., In C. L. Gyles y C. O. Thoen (ed.), Pathogenesis of Bacterial Infections in Animáis, lowa State University Press, Ames, p. 216-225 (1993), incorporado a la presente memoria por referencia].

La infección por P. multocida resulta generalmente de la invasión durante periodos de estrés, pero la transmisión puede ocurrirtambién por aerosol o por exposición por contacto, o por medio de pulgas y garrapatas vectores. En aves de corral, la infección por P. multocida da lugar a septicemia de aguda a peraguda, particularmente prevalente en pavos domésticos y aves acuáticas salvajes en condiciones de estrés asociadas con hacinamiento, puesta, muda, o cambio climático grave. En ganado, una septicemia hemorrágica similar sigue a la infección y manifiesta afecciones que incluyen fiebre alta y depresión, seguidas generalmente por muerte rápida. La transmisión es contacto con aerosol más probable, pero la infección puede surgir durante periodos de cambio climático significativo. En conejos, la infección da lugar a rinitis purulenta recurrente, generalmente seguida por conjuntivitis, otitis media, sinusitis, abcesos subcutáneos y bronconeumonía crónica. En infecciones graves, la mortalidad de conejos surge de bronconeumonía fibrinosa aguda, septicemia, o endotoxemia. Los estados morbosos normalmente surgen durante periodos de estrés. En cerdos, los estados morbosos de P. multocida comunes incluyen rinitis atópica y neumonía bacteriana. Afecciones pulmonares similares también se detectan en perros, gatos, cabras y ovejas. P. multocida se detecta comúnmente en la flora oral de muchos animales y es por lo tanto un contaminante común en heridas de mordiscos y de arañazos.

Las cepas de P. multocida se designan normalmente por los serogrupos capsular y somático. Se distinguen cinco serogrupos capsulares (A, B, D, E y F) y 16 serotipos somáticos por expresión de antígenos térmicamente estables característicos. La mayoría de las cepas son específicas de huésped y raramente infectan más de uno o dos animales. La existencia de serotipos diferentes presenta un problema para vacunación debido a que las células bacterianas completas muertas proporcionan normalmente solo protección específica de serotipo. Sin embargo, se ha demostrado que la infección natural con un serotipo puede conducirá protección inmunológica contra serotipos múltiples [Shewen y cois., In C. L. Gyles y C. O. Thoen (Ed ), Pathogenesis of Bacterial Infections in Animáis, lowa State University Press, Ames, p. 216-225 (1993)] y se puede estimular protección cruzada usando bacterias inactivadas in vivo [Rimlery cois., Am J Vet Res. 42: 2117-2121 (1981)]. Una cepa de P. multocida mutante espontánea se ha utilizado como una vacuna y se ha mostrado que estimula una respuesta inmune fuerte [Davis, Poultry Digest. 20: 430-434 (1987), Schlinky cois., Avian Dis. 31 (1): 13-21 (1987)]. Esta cepa atenuada, sin embargo, ha mostrado revertirá un estado virulento o causar mortalidad si el receptor de la vacuna está estresado [Davis, Poultry Digest. 20: 430-434 (1987), Schlinky cois., Avian Dis. 31 (1): 13-21 (1987)];

Otro miembro de la familia de las pasteureláceas, A. pleuropneumoniae muestra especificidad de huésped estricta para cerdos y es el agente causante de pleuroneumonía porcina altamente contagiosa. La infección surge normalmente en condiciones de cría intensiva y se cree que ocurre por un modo directo de transmisión. La infección es a menudo fatal y como resultado conduce a pérdida económica grave en la industria de producción porcina. Una infección de pleuroneumonía puede ser aguda o crónica y la infección se caracteriza por una bronconeumonía hemorrágica, necrótica con pleuritis fibrinosa acompañante. Hasta la fecha, la virulencia bacteriana se ha atribuido a proteínas estructurales, incluyendo polisacáridos capsulares específicos de serotipo, lipopolisacáridos y proteínas de superficie, así como a toxinas citolíticas extracelulares. A pesar de la purificación y en algunos casos clonación, de estos factores de virulencia, el papel exacto de estos factores de virulencia en una infección de pleuroneumonía se entiende pobremente.

Se han identificado doce serotipos de A. pleuropneumoniae basándose en diferencias antigénicas en polisacáridos vasculares y en producción de toxinas extracelulares. Los serotipos 1, 5 y 7 son más relevantes para infección de A. pleuropneumoniae en los Estados Unidos, mientras que los serotipos 1, 2, 5, 7 y 9 son predominantes en Europa. Estas son al menos tres toxinas extracelulares significativas de A. pleuropneumoniae que son miembros de la familia de las hemolisinas y se refieren como toxinas RTX. Las toxinas RTX se producen por muchas bacterias gram

negativas, incluyendo E. coli, Proteus vulgarisa y Pasteurella haemolytica y las proteínas muestran generalmente características estructurales y funcionales. Las toxinas a partir de los diversos serotipos difieren, sin embargo, en especificidad de huésped, células objetivo y actividades biológicas.

Las toxinas de A. pleuropneumoniae RTX principales incluyen Apxl, Apxll y Apxlll. Apxl y Apxll tienen actividad hemolítica, con Apxl siendo más potente. Apxlll no muestra ninguna actividad hemolítica, pero es citotóxica para macrófagos alveolares y neutrófilos. La mayoría de los serotipos de A. pleuropneumoniae producen dos de estas tres toxinas. Por ejemplos, los serotipos 1, 5, 9 y 11 expresan Apxl y Apxll y los serotipos 2, 3, 4, 6 y 8 expresan Apxll y Apxlll. El serotipo 10, sin embargo, produce solo Apxl y serotipos 7 y 12 expresan solo Apxll. Aquellos serotipos de A. pleuropneumoniae que producen tanto Apxl como Apxll son las cepas más virulentas de las bacterias.

Las toxinas de Apx se demostró que eran factores de virulencia en modelos murinos e infección porcina usando bacterias de tipo silvestre mutadas al azar [Tascon y cois., Mol. Microbiol. 14: 207-216 (1994)]. Otros mutantes de A. pleuropneumoniae se han generado también con mutagénesis dirigida para inactivar el gen que codifica la proteína de virulencia de membrana exterior de AopA [Mulks y Buysee, Gene 165: 61-66 (1995)].

En intentos de producir composiciones de vacunas, las células bacterianas completas muertas tradicionales han proporcionado solo protección de serotipos [Maclnnes y Smart, supra], sin embargo, se ha demostrado que la infección natural con un serotipo altamente virulento puede estimular fuerte inmunidad protectora contra serotipos múltiples... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Una bacteria atenuada de Pasteurella multocida, que comprende una mutación en un gen representado por una secuencia polinucleotídica que codifica un polipéptido fhaC

(¡) en la que la secuencia polinucleotídica híbrida con el complemento de la SEC ID N.O: 19 en condiciones restrictivas, comprendiendo tales condiciones un lavado final en tampón que comprende SSC 2X/SDS al 0,1 %, a 35°C hasta 45°C, o

(¡i) en la que el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos al menos idéntica en un 80 % a la SEC ID NO: 20, en la que la atenuación de la bacteria está causada por dicha mutación.

2. La bacteria de la reivindicación 1, en la que dicha mutación da como resultado la expresión disminuida de un producto génico codificado por el gen mutado.

3. La bacteria de la reivindicación 1, en la que dicha mutación da como resultado la expresión de un producto génico inactivo codificado por el gen.

4. La bacteria de la reivindicación 1, en la que dicha mutación da como resultado la deleción de todo o parte de dicho gen.

5. La bacteria de la reivindicación 1, en la que dicha mutación da como resultado una inserción en dicho gen.

6. La bacteria de la reivindicación 1, en la que la mutación está en la secuencia polinucleotídica de SEC ID NO: 19.

7. Una composición inmunogénica que comprende la bacteria de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

8. Una composición vacunal que comprende una composición inmunogénica de la reivindicación 7 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

9. La composición vacunal de la reivindicación 8, que comprende adicionalmente un coadyuvante.

10. Un polinucleótido purificado y aislado que comprende una secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido que tiene SEC ID NO: 20.

11. El polinucleótido de la reivindicación 10, que comprende SEC ID NO: 19.

12. Un polipéptido purificado que comprende SEC ID NO: 20.